大豆蛋白與千葉豆腐品質特性的關系

王喜波，聶 鑫，廖 一，羅佳倩，呂秀莉，劉季善，劉 軍，王中江，滕 飛，李 良，李 楊,4,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.山東萬得福實業集團有限公司，山東 東營 257000；3.山東禹王生態食品有限公司，山東 德州 251200；4.哈爾濱市食品產業研究院，黑龍江 哈爾濱 150030）

千葉豆腐是由大豆蛋白通過添加轉谷氨酰胺酶、淀粉等輔料形成的一種蛋白凝膠產品，不僅營養豐富，同時兼具豆腐的細嫩及特有的爽滑和筋道口感[1-2]。千葉豆腐因其優良的感官品質及較強的烹調入味能力，受到消費者的喜愛，廣泛流行于日本、中國沿海及北方地區[2]。

千葉豆腐的品質主要受原料蛋白、輔料和加工工藝等因素的影響，其中原料蛋白質特性是影響千葉豆腐品質的關鍵因素之一，蛋白質的氨基酸組成及結構對大豆蛋白凝膠產品的加工特性起到重要的影響[3-7]。陳復生[8]指出，大豆蛋白的含硫氨基酸對凝膠質構特性具有重要影響，高含硫氨基酸使凝膠形成更多二硫鍵，形成高強度凝膠。Wang Xuefeng等[9]研究8 個大豆品種的氨基酸組成對酶促凝膠質構的影響，結果表明不同氨基酸組成的大豆蛋白凝膠硬度差異顯著。董昳廷[10]指出蛋白凝膠的彈性、保水性、硬度可能與蛋白質二級結構中α-螺旋和β-折疊相對含量有關。Li Chuanyun等[11]研究發現酶促凝膠中β-折疊相對含量高時，凝膠強度、保水性和非凍結水含量等均較高。Mujoo等[4]研究證明11S亞基含量與11S/7S比例都與豆腐硬度呈正相關關系，而7S亞基含量與之呈負相關關系。Nagano等[5]研究發現大豆11S球蛋白較大豆分離蛋白可形成硬度更大的凝膠，但大豆11S球蛋白凝膠結構粗糙并且凝膠渾濁；大豆7S球蛋白凝膠透明度高但硬度低，只有合適的11S/7S比例才能形成結構細膩、透明度高的大豆蛋白凝膠產品。

先前的研究多集中在探索原輔料種類和添加量對千葉豆腐品質影響，而對原料蛋白質特性的研究甚少。因此，本實驗以16 個品種的大豆蛋白為原料，研究了不同來源的大豆蛋白氨基酸組成、二級結構、亞基組成等蛋白特性，同時對大豆蛋白加工成千葉豆腐的品質特性進行了分析，旨在探討影響千葉豆腐品質的蛋白質原料特性，并考察不同大豆蛋白制作千葉豆腐的品質特性，為選擇適用于制作千葉豆腐的大豆蛋白原料及工業化千葉豆腐加工提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕1～11號由山東萬得福實業集團提供，低溫脫脂豆粕12～16號由山東禹王生態食業有限公司提供。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、彩虹廣譜蛋白Marker 北京索萊寶科技有限公司；氨基酸混合標準品 美國Sigma公司；轉谷氨酰胺酶 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

ME54E/204E型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ-1型增力電動攪拌器 上?？粕齼x器有限公司；PHSJ-4A型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；Mini-PROTEAN Trtra型垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；MAGNA-IR560型傅里葉變換紅外光譜儀美國Thermo公司；3-18K型高速冷凍離心機 美國Sigma公司；LLOYD TA1型質構分析儀 美國Ametek公司；SU8010型場發射掃描電子顯微鏡 英國Quorum公司；K600型多功能食物調理機 德國博朗公司；FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司。

1.3 方法

1.3.1 豆粕基本組分的測定

豆粕蛋白質量分數的測定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》；豆粕脂肪質量分數的測定：參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》；豆粕灰分質量分數的測定：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》；豆粕水分質量分數的測定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》；豆粕粗纖維素質量分數的測定：參照GB/T 5515—2008《糧油檢驗糧食中粗纖維素含量測定》；豆粕氮溶解指數的測定：參考于濱等[12]的方法，稱取0.5 g樣品加入50 mL蒸餾水，30 ℃水浴下攪拌1 h，2 000 r/min離心10 min，取15 mL上清液進行微量凱氏定氮以測定其含氮量。氮溶解指數按下式計算。

1.3.2 大豆分離蛋白的制備

參考Petruccelli等[13]的制備方法。低溫脫脂豆粕粉碎后過60 目篩，得到的豆粕粉與去離子水（1∶10，m/V）混合后，用1 mol/L NaOH溶液將混合溶液的pH值調節至8.5，室溫下攪拌2 h，在4 ℃、9 000 r/min下離心20 min，取上清液用2 mol/L HCl溶液調節pH值至4.5后靜置2 h，在4 ℃、6 000 r/min下將其離心20 min，得蛋白質沉淀物，將蛋白質沉淀物用去離子水洗3 次后溶解，用1 mol/L NaOH溶液調節蛋白溶液pH值至7，將此蛋白溶液冷凍干燥后研磨，即可得到大豆分離蛋白。

1.3.3 氨基酸分析

參考Wu Huichun等[14]的方法，在110 ℃下，用6 mol/L HCl溶液將樣品在密封的水解管中水解24 h。水解后冷卻至室溫，使用去離子水定容至25 mL，溶液過0.45 μm膜后取1 mL進行干燥，將干燥的樣品用1 mL 6 mol/L HCl溶液溶解后，使用氨基酸分析儀進行測定，進樣量為30 μL。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析

參考劉勤勤等[15]的方法，將3 mg大豆分離蛋白與溴化鉀粉末按1∶100（m/m）的比例混合后壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品進行掃描，分辨率4 cm－1，掃描波段4 000～400 cm－1，掃描次數32。使用Peakfit Version軟件處理樣品的傅里葉變換紅外光譜圖。

1.3.5 SDS-PAGE分析

參考Xia Xiufang等[16]的方法稍作修改：精確稱取不同大豆分離蛋白，使其溶解后終質量濃度為2 mg/mL，上樣前沸煮5 min，上樣量為20 μL，分離膠質量分數為15%，濃縮膠質量分數為5%，初始電壓為80 V，待樣品進入分離膠后提高電壓至120 V。電泳結束后用考馬斯亮藍R250溶液染色，脫色4～5 次至完全脫色后，采用Gel Doc EZ imager型凝膠成像系統分析電泳條帶。

1.3.6 千葉豆腐制作

參考江程明[2]的方法：精確稱量15 g大豆分離蛋白、5 g淀粉及80 mL水加入調理機中攪打約3 min。然后慢速加入0.12 g谷氨酰胺轉胺酶，再快速打漿2 min至均勻。之后再慢速打漿，同時慢慢加入適量大豆油、味精、食鹽等其他配料，再快速打漿5 min，使漿液細膩且無小氣泡時即可。過程中溫度控制在12 ℃以下。將打好的漿液倒入托盤，漿液厚度4 cm，表面蓋上保鮮膜，冷藏定型10 h。冷藏后于80～85 ℃蒸煮40 min，使產品中心溫度達75 ℃以上，冷卻至常溫后切塊。經冷凍后包裝，然后移入冷庫貯存，凍藏溫度為－18 ℃。

1.3.7 千葉豆腐質構特點分析

將千葉豆腐切成20 mm×20 mm×12 mm的塊狀，使用質構儀對千葉豆腐的硬度、彈性、黏聚性、膠著性、咀嚼性、回復性進行測定。測定參數：測定速率120 mm/min；測后速率120 mm/min；壓縮比70%；兩次下壓間隔時間：5 s，探頭類型為壓盤式測試探頭P25（25 mm）。

1.3.8 感官評定

將千葉豆腐解凍至室溫后切片裝盤，選擇20 名專業感官鑒評人員（男性10 名、女性10 名）對1～16號千葉豆腐進行評估，并對千頁豆腐各感官指標進行評分，評分項目與評分標準參考江程明[2]的方法（表1）。

表1 千葉豆腐感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Qianye tofu

1.3.9 千葉豆腐微觀結構觀察

千葉豆腐的微觀結構采用掃描電子顯微鏡進行觀察分析。將千葉豆腐樣品切成0.8 cm×0.6 cm×0.1 cm的薄片，然后進行固定（pH 6.8戊二醛溶液，4 ℃固定2 h），沖洗（pH 6.8磷酸鹽緩沖液沖洗2～3 次，每次10 min），脫水（體積分數為50%、70%、90%的乙醇溶液各洗脫一次，每次10 min，無水乙醇洗脫2～3 次，每次10 min），置換（V（無水乙醇）∶V（叔丁醇）＝1∶1和純叔丁醇各置換一次，每次15 min），冷凍干燥，粘樣，涂覆金濺射，樣品處理完成后，在5 kV條件下進行微觀結構觀察。

1.4 數據處理與分析

每組進行3 次平行實驗，并將實驗數據進行誤差分析。采用統計學軟件SPSS 18對數據采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 豆粕基本理化指標

豆粕中蛋白質、脂肪、灰分、水分、粗纖維素質量分數、氮溶解指數的測定結果見表2。

表2 不同豆粕的理化指標Table 2 Physicochemical indices of soybean meals from different varieties

粗蛋白質量分數、粗脂肪質量分數、水分質量分數、灰分質量分數、粗纖維素質量分數、氮溶解指數是區分豆粕原料品質的基礎指標，與豆粕加工性能密切相關[17-20]。由表2可知，豆粕的蛋白質量分數范圍為55.14%～57.01%，平均值為55.92%，變異系數為1.01%；脂肪質量分數范圍為0.39%～0.69%，平均值為0.53%，變異系數為16.90%；灰分質量分數范圍為5.14%～6.21%，平均值為5.73%，變異系數為6.02%；水分質量分數范圍為8.04%～9.01%，平均值為8.53%，變異系數為3.10%；粗纖維素質量分數范圍為2.51%～3.19%，平均值為2.92%，變異系數為8.09%；氮溶解指數分布范圍為80.41%～87.73%，平均值為83.16%，變異系數為2.92%。16 種豆粕的指標均符合GB 21494—2008《低溫食用豆粕》一級低溫食用豆粕對粗蛋白質量分數（不低于55%）、粗脂肪質量分數（不高于1.0%）、水分質量分數（不高于10.0%）、灰分質量分數（不高于6.5%）、粗纖維素質量分數（不高于3.5%）、氮溶解指數（不低于80%）的要求。

2.2 氨基酸組成分析結果

蛋白質的營養價值主要是由氨基酸組成和含量決定，特別是必需氨基酸的組成與含量[21]。由表3可知，大豆蛋白中氨基酸種類齊全，其中谷氨酸相對含量最高，其次為天冬氨酸，而甲硫氨酸和胱氨酸相對含量較低。大豆蛋白中必需氨基酸、半必需氨基酸、非必需氨基酸相對含量范圍分別為28.92%～32.38%、9.38%～10.68%、50.15%～54.40%，平均值分別為30.69%、9.88%、52.17%，變異系數分別為3.45%、3.52%、2.01%。由表3可知，大豆蛋白中必需氨基酸/氨基酸總量比值范圍為32.24%～34.14%，必需氨基酸/非必需氨基酸相對含量比值范圍為56.69%～61.94%，營養價值較高。大豆球蛋白（11S）中含有20 個二硫鍵和2 個巰基，而β-伴大豆球蛋白（7S）中僅含有2 個二硫鍵且不含巰基，這主要與不同亞基之中含硫氨基酸（甲硫氨酸和半胱氨酸）含量有關，因此含硫氨基酸的含量能一定程度上反映11S和7S亞基的相對含量，而凝膠的硬度等質構特性與11S和7S亞基的含量與比例密切相關[7,22]。結果表明，16 種大豆蛋白中含硫氨基酸相對含量范圍為2.48%～3.14%，平均值為2.73%，變異系數為6.75%；其中10號樣品中含硫氨基酸相對含量最高，為3.14%，6號樣品中含硫氨基酸相對含量最低，為2.48%。

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析結果

蛋白質的二級結構可以通過傅里葉變換紅外光譜的酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）進行定量分析。參考Qi Baokun等[23]的方法，擬合圖譜中各子峰與蛋白質不同二級結構對應關系：α-螺旋結構為1 650～1 660 cm－1；平行式β-折疊結構為1 618～1 640 cm－1；反平行式β-折疊結構為1 670～1 690 cm－1；β-轉角結構為1 660～1 670 cm－1；無規卷曲結構為1 643～1 647 cm－1。使用PeakFit 4.12軟件對傅里葉變換紅外光譜進行曲線擬合，通過峰位歸屬和峰面積積分確定二級結構種類和相對含量，結果見表4。

蛋白凝膠的質構特性與蛋白質二級結構相對含量密切相關[24-25]。由表4可知，蛋白質二級結構中α-螺旋相對含量范圍為11.70%～16.86%，平均值為14.14%，變異系數為13.18%；平行式β-折疊相對含量范圍為32.01%～41.57%，平均值為36.22%，變異系數為10.12%；反平行式β-折疊相對含量范圍為19.44%～20.92%，平均值為20.06%，變異系數為2.19%；β-轉角相對含量范圍為14.42%～15.21%，平均值為14.80%，變異系數為1.40%；無規卷曲相對含量范圍為11.68%～16.78%，平均值為14.68%，變異系數為13.21%。β-折疊結構是蛋白質聚集和凝膠形成的關鍵，增加蛋白質中β-折疊結構相對含量可以顯著提高凝膠的硬度等質構特性[8]。同時，由表4可知，不同大豆蛋白的平行式β-折疊結構相對含量較反平行式β-折疊結構相對含量差異更加顯著。10號樣品的β-折疊結構相對含量最高，為61.76%，其中平行式β-折疊結構相對含量為41.57%；7號樣品中β-折疊結構相對含量最低，為51.70%，其中平行式β-折疊結構相對含量為32.26%。無規卷曲為無序結構，蛋白質中無序結構相對含量高時，形成低硬度、低彈性的凝膠[8]。4號和6號樣品的無規卷曲相對含量最高，為16.78%；12號樣品中無規卷曲相對含量最低，為11.68%。

表3 不同大豆蛋白氨基酸的相對含量Table 3 Amino acid relative contents of different soybean proteins

表4 不同大豆蛋白二級結構的相對含量Table 4 Relative contents of secondary structures in soybean proteins from different varietiies

2.4 SDS-PAGE分析結果

圖1 不同大豆蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE profi les of soybean proteins from different varieties

蛋白質是決定大豆蛋白制品加工性能的主要因素，但并非所有大豆蛋白組分都與大豆蛋白凝膠產品的最終品質有關。與大豆蛋白凝膠產品品質密切相關的蛋白組分是大豆球蛋白（11S）和β-伴大豆球蛋白（7S），7S和11S是大豆中的主要貯藏蛋白，占到大豆蛋白總量的70%，其含量與組成直接影響大豆蛋白凝膠產品的營養價值與產品特性[7,22]。

由圖1可知，不同大豆蛋白亞基組成基本相同，7S與11S亞基條帶清晰可見。使用Gel Doc EZ imager型凝膠成像系統，對不同大豆蛋白電泳圖像進行掃描分析，得出大豆蛋白中7S亞基（包括α’亞基、α亞基和β亞基）、11S亞基（包括A3亞基、A4亞基、A1,2亞基和B亞基）相對含量和兩者比例，結果見表5。

表5 不同大豆蛋白亞基的相對含量Table 5 Relative contents of subunits in soybean proteins from different varieties

大豆蛋白中7S亞基和11S亞基兩者的相對含量、比例以及亞基組成對大豆蛋白凝膠的質構特性影響顯著[4-5,26]。由表5可知，7S、11S相對含量及11S/7S比例范圍分別為25.45%～31.42%、43.50%～52.21%、1.44～2.05，平均值分別為27.82%、48.38%、1.75，變異系數分別為5.68%、5.25%、9.18%。11S凝膠在凝膠形成時主要依靠靜電相互作用和二硫鍵形成穩定的三維網絡結構，而7S凝膠形成僅依靠氫鍵，因此大豆蛋白中11S亞基含量影響凝膠硬度，而7S亞基含量影響凝膠彈性[7]。同時大豆蛋白中11S/7S比例、A4亞基、A1,2亞基與大豆蛋白凝膠的質構特性存在顯著相關關系，且相關關系與品種類型密切相關[26-30]。由表5可知，10號大豆蛋白11S/7S比例最高，為2.05，16號大豆蛋白11S/7S比例最低，為1.44；A4亞基相對含量最高為10號大豆蛋白（18.63%），相對含量最低為13號大豆蛋白（13.64%）；A1,2亞基相對含量最高為15號大豆蛋白（7.15%），相對含量最低為4號大豆蛋白（4.88%）。

2.5 千葉豆腐質構特性

質構分析測試可以一次提供多個參數，從不同的角度來反映樣品的物理性狀。質構分析測試也被稱作“兩次咬合測試”，通常是對樣品進行兩次壓縮，從而對樣品的硬度等質構特性進行定量分析。質構特性是評價千葉豆腐品質的重要手段之一，硬度、彈性、黏聚性、膠著性、咀嚼性、回復性是千葉豆腐質構評價的主要指標[4,9,11,31]。

由表6可知，不同大豆蛋白制得千葉豆腐的硬度、彈性、黏聚性、膠著性、咀嚼性、回復性分布范圍分別為209.32～344.19 g、0.88～1.15 mm、0.92～0.96、197.58～323.10 N、175.38～371.32 N、0.73～0.76，平均值分別為267.41 g、1.01 mm、0.94、250.92 N、257.29 N、0.75，變異系數分別為15.32%、7.94%、1.33%、15.47%、22.49%、1.47%。3、9、10、15號大豆蛋白制得千葉豆腐的硬度和彈性較高，具有較強的抗變形能力與形狀恢復能力；而11、13、16號蛋白制得的千葉豆腐硬度和彈性較低，抗變形能力與形狀恢復能力較差。

千葉豆腐的質構特性主要受蛋白質網狀結構影響，蛋白質氨基酸組成和二級結構組成影響蛋白質亞基組成，而亞基組成是決定千葉豆腐網狀結構的關鍵[5,11,27,31-32]。大豆蛋白的11S亞基中含硫氨基酸含量顯著高于7S亞基，含硫氨基酸在膠凝時可形成二硫鍵，二硫鍵可以形成更加穩定的三維網狀結構，故11S亞基含量高的蛋白質制得的凝膠硬度高[4-5,9]。蛋白質二級結構的含量差異會引起蛋白質高級結構的含量差異，其中β-折疊結構是蛋白質的主要有序結構，蛋白質中有序結構含量越高，蛋白質凝膠的網狀結構越致密，凝膠硬度越高[8,33-34]。本研究中，不同大豆蛋白制得千葉豆腐的質構特性差異較大，硬度最高的10號樣品中含硫氨基酸含量為3.14%，平行式β-折疊結構含量為41.57%，11S/7S為2.05，而硬度最低的13號樣品中含硫氨基酸含量為2.43%，平行式β-折疊結構含量為32.41%，11S/7S為1.59，表現出較大差異。說明大豆蛋白的含硫氨基酸含量、二級結構相對含量與亞基相對含量對千葉豆腐的質構特性有較大影響。

2.6 千葉豆腐感官評定

由表7可知，千葉豆腐樣品感官評價中的總體可接受性評分分布在4.5～8.8，其中口感、彈性、組織狀態評分差異顯著，但樣品的味道、色澤評分差異不顯著。10號樣品的總體可接受性評分最高，為8.8；16號樣品的總體可接受性評分最低，為4.5。結果表明大豆蛋白特性的差異顯著影響千葉豆腐的感官特性。

2.7 千葉豆腐微觀結構分析結果

圖2 千葉豆腐掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 Scanning electron micrographs of Qianye tofu

圖2顯示，不同大豆蛋白制得的千葉豆腐表面結構不同，其中10號與15號千葉豆腐表面結構致密，孔洞分布均勻且孔徑較小，8、12號及16號千葉豆腐表面結構粗糙，孔洞分布不均勻且孔徑較大。這種表觀結構差異是因為不同大豆蛋白具有不同的蛋白特性，會形成結構不同的凝膠，而凝膠結構的不同顯著影響凝膠產品品質特性[35]。掃描電子顯微鏡觀察結果與感官評定和質構分析結果相一致，表明大豆蛋白特性顯著影響千葉豆腐品質特性。

2.8 主成分分析結果

主成分分析是在盡可能多地反映原始變量信息的基礎上，將多個變量通過線性變化以選出較少數重要變量的一種統計方法。本實驗對氨基酸組成、蛋白質二級結構、蛋白質亞基組成、千葉豆腐質構特性及感官評分中的11 個指標進行主成分分析，包括甲硫氨酸、胱氨酸、α-螺旋、平行式β-折疊、無規卷曲、β亞基、A4亞基、A1,2亞基相對含量以及11S/7S、硬度、彈性。

圖3 千葉豆腐主成分分析載荷圖Fig. 3 Loading plot of principal component analysis for Qianye tofu

由圖3可知，3 個主成分的總方差貢獻率為92.15%，數據信息損失量為7.85%，數據信息損失量較少，結果具有代表性。第一主成分（PC1）方差貢獻率為58.28%，是最主要的主成分，第二和第三主成分方差貢獻率分別為20.24%、13.63%，且3 個主成分特征值均大于1。因此，3 個主成分可以說明大豆蛋白與千葉豆腐品質特性的關系。第一主成分包括α-螺旋、平行式β-折疊、無規卷曲、A4亞基、A1,2亞基相對含量以及11S/7S、硬度、彈性，其中平行式β-折疊、A4亞基、A1,2亞基相對含量以及11S/7S、硬度、彈性呈正相關，而α-螺旋相對含量與無規卷曲相對含量呈負相關，表明蛋白質二級結構和11S亞基相對含量、千葉豆腐質構特性是影響千葉豆腐品質特性的主要因素。第二主成分包括甲硫氨酸、胱氨酸相對含量，且均呈正相關，表明蛋白質含硫氨基酸相對含量是影響千葉豆腐品質特性次要因素。第三主成分包括β亞基相對含量，且呈負相關，表明7S亞基相對含量是影響千葉豆腐品質特性的次要方面。

3 結 論

為明確大豆蛋白與千葉豆腐品質特性的關系，本實驗以16 個品種的大豆蛋白為原料，研究了不同來源的大豆蛋白氨基酸組成、二級結構、亞基組成等蛋白特性和不同品種的大豆蛋白對千葉豆腐的質構、感官性質及微觀結構等的影響。研究發現：甲硫氨酸、胱氨酸、α-螺旋、平行式β-折疊、無規卷曲、β亞基、A4亞基、A1,2亞基相對含量以及11S/7S、硬度、彈性存在顯著差異，說明大豆蛋白特性是決定千葉豆腐品質特性的重要指標。進一步通過主成分分析研究影響千葉 豆腐品質特性的主要因素。結果表明，含硫氨基酸相對含量（高于（2.81±0.02）%）、平行式β-折疊相對含量（高于（39.96±0.57）%）及11S/7S比例（高于1.88±0.16）的大豆蛋白可制得高品質千葉豆腐。本實驗為實際生產中選擇適合制作千葉豆腐的蛋白質原料提供了一定的參考指標。