銀杏葉提取物對間歇性低氧小鼠氧化應激及胰腺Nrf2-ARE通路蛋白表達的干預作用

肖麗君，周燕，湯宇飛

桂林醫學院附屬醫院，廣西桂林541001

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)主要特點是在睡眠期間反復出現間歇性缺氧，可引發氧化應激和全身炎癥反應，進而導致活性氧(ROS)、抗氧化酶和炎癥因子的釋放。核因子E2相關因子2-抗氧化反應元件(Nrf2-ARE)信號通路由轉錄因子Nrf2、調控蛋白Keap1及抗氧化反應元件ARE組成。研究表明，Nrf2-ARE信號通路是迄今為止發現的最重要的內源性抗氧化應激通路[1]。Nrf2作為氧化應激的重要調節因子，在生理狀況下，Nrf2與Keapl結合且以非活性狀態存在于胞質中，并經泛素蛋白酶體途徑迅速降解，保持低轉錄活性[2]；在受到ROS的刺激后，Nrf2進入細胞核并與ARE序列結合，激活下游靶基因及其產物，如血紅素加氧酶1(HO-1)、苯醌氧化還原酶1(NQO1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)等表達[3]，減少ROS的產生，減輕氧化應激對機體的損傷。銀杏葉提取物(EGB)是從銀杏葉中提取的活性物質，含有22%～27%的銀杏黃酮和5%～7%的萜烯內酯[4]，這些活性化合物可防止脂質過氧化，減輕氧化應激，減少細胞凋亡，并抑制炎癥反應[5]。研究發現，OSAS與2型糖尿病(T2DM)、糖代謝障礙和胰島素抵抗密切相關[6]。還有研究發現，胰腺組織抗氧化酶的表達相對較少，容易受到ROS等的影響[7]。為探討慢性間歇性低氧(CIH)對胰腺組織的損傷機制，2018年3月～2019年6月，本研究觀察了EGB對CIH小鼠氧化應激及胰腺組織Nrf2-ARE通路相關蛋白表達的干預作用，為OSAS及其并發癥的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 健康8周齡C57BL/6雄性小鼠42只，體質量(20±2)g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司。所有動物飼養于實驗動物中心，12 h明暗周期、溫度(23±3)℃、相對濕度45%～65%，給予標準的飲用水和鼠糧。本研究動物處理程序和實驗方案已獲得桂林醫學院附屬醫院倫理委員會的批準。EGB(EGB761，金納多)購自德國Schwabe制藥集團；Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS單克隆抗體購自美國Abcam公司；小鼠β-actin抗體、辣根酶標記抗兔IgG二抗、辣根酶標記抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。全自動低氧動物艙(型號JXOC-12)購自南京新飛公司；實時熒光定量PCR儀(CFX96)購自美國伯樂公司；多功能酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司。

1.2 動物模型制備及給藥方法 健康C57BL/6雄性小鼠42只，適應性喂養1周后按隨機數字表法分為常氧對照組、間歇性低氧組、Nrf2激活劑組、抗Nrf2抗體組及EGB低、中、高濃度組，每組6只。間歇性低氧組、Nrf2激活劑組、抗Nrf2抗體組及EGB低、中、高濃度組建立間歇性低氧模型，模擬間隙性的缺氧-復氧狀態：小鼠置于間歇性低氧艙內，循環充入氮氣和氧氣，每循環120 s，充入氮氣使最低氧濃度為4%～6%，維持20～30 s，隨之充入氧氣至21%，8 h/d(9：00～17：00)。常氧對照組每日同時置于相同規格的有機玻璃艙內，空氣輸入，無缺氧，其余時間置于飼養籠常規飼養。造模10周結束后開始給藥，常氧對照組、間歇性低氧組予1 mL/d生理鹽水腹腔注射，Nrf2激活劑組予Nrf2激活劑萊菔硫烷5 mg/(kg·d)腹腔注射，抗Nrf2抗體組予抗Nrf2抗體5 mg/(kg·d)腹腔注射，EGB低、中、高濃度組分別給予50、100、200 mg/(kg·d)的EGB灌胃。藥物干預第10周末，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，眼眶后靜脈叢采血，4 ℃下3 000 r/min離心20 min，-20 ℃保存。無菌條件下取出小鼠胰腺組織，迅速液氮中速凍，-80 ℃凍存備用。

1.3 血清氧化應激指標檢測 采用ELISA法檢測血清T-AOC、MDA、GSH-Px含量。

1.4 胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS mRNA及蛋白檢測

1.4.1 Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS mRNA檢測 使用TRIzol試劑提取胰腺組織總RNA，使用多功能酶標儀測定總RNA濃度。將RNA逆轉錄成cDNA并擴增。內參GAPDH上游引物序列為5′-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3′，下游引物序列為5′-GAGTTGTCATATTTCTCGTGG-3′；Nrf2上游引物序列為5′-ACAGTGCTCCTATGCGTGAA-3′，下游引物序列為5′-TCTGGGCGGCGACTTTAT-3′；HO-1上游引物序列為5′-CCCAAAACTGGCCTGTAAAA-3′，下游引物序列為5′-CGTGGTCAGTCAACATGGAT-3′；NQO1上游引物序列為5′-AGGATGGGAGGTACTCGAATC-3′，下游引物序列為5′-AGGCGTCCTTCCTTATATGCTA-3′；γ-GCS上游引物序列為5′-CAGGACAGCCTAGTCTGGGGAA-3′，下游引物序列為5′-CAGGACAGCCTAGTCTGGGGAA-3′。使用Power SYBR Green PCR Master Mix和CFX96 real-time PCR儀進行PCR反應。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.4.2 Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS蛋白檢測 用RIPA裂解緩沖液在冰上處理胰腺組織，4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，以獲得上清液，BCA蛋白質檢測試劑盒檢測蛋白質濃度；使用SDS-PAGE分離蛋白質，然后將電泳產物轉移到PVDF膜上；5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，加入一抗(1∶1 000)4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌3次(10 min/次)；加入二抗(1∶5 000)，在室溫下放置2 h；洗滌后，將ECL發光液加到膜上，使用壓片法觀察免疫反應。用Image J軟件分析條帶光密度值。將β-actin作為內部對照，以目的條帶與β-actin的光密度比值作為蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠血清氧化應激指標水平比較 間歇性低氧組、抗Nrf2抗體組血清T-AOC、GSH-Px水平低于常氧對照組，MDA水平高于常氧對照組(P均<0.05)；Nrf2激活劑組及EGB高濃度組血清T-AOC、GSH-Px水平高于常氧對照組，MDA水平低于常氧對照組(P均<0.05)；Nrf2激活劑組及EGB低、中、高濃度組血清T-AOC、GSH-Px水平高于間歇性低氧組，MDA水平低于間歇性低氧組(P均<0.05)；抗Nrf2抗體組血清T-AOC、GSH-Px水平低于間歇性低氧組，MDA水平高于間歇性低氧組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組小鼠胰腺組織中Nrf2-ARE信號通路相關蛋白mRNA表達比較 間歇性低氧組、抗Nrf2抗體組胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS mRNA相對表達量低于常氧對照組，Nrf2激活劑組及EGB高濃度組Nrf2、NQO1、γ-GCS mRNA相對表達量高于常氧對照組(P均<0.05)；Nrf2激活劑組及EGB高濃度組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS mRNA相對表達量高于間歇性低氧組，抗Nrf2抗體組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS mRNA相對表達量低于間歇性低氧組(P均<0.05)。見表2。

表1 各組小鼠血清T-AOC、MDA、GSH-Px水平比較

注： 與常氧對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與間歇性低氧組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3 各組小鼠胰腺組織中Nrf2-ARE信號通路相關蛋白表達 間歇性低氧組及抗Nrf2抗體組胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1相對表達量低于常氧對照組，Nrf2激活劑組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS相對表達量高于常氧對照組(P均<0.05)；Nrf2激活劑組及EGB中、高濃度組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS相對表達量高于間歇性低氧組，抗Nrf2抗體組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS相對表達量低于間歇性低氧組(P均<0.05)；EGB高濃度組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS表達高于EGB中濃度組(P均<0.05)。見表3。

表2 各組小鼠胰腺組織Nrf2-ARE信號通路相關蛋白mRNA表達比較

注：與常氧對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與間歇性低氧組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

表3 各組小鼠胰腺組織中Nrf2-ARE信號通路相關蛋白表達比較

注： 與常氧對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與間歇性低氧組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

OSAS是一種睡眠呼吸障礙疾病，其特征是在睡眠過中反復發生缺氧和再氧合，引起體內ROS增多，破壞了氧化系統和抗氧化系統的平衡，從而導致氧化應激。氧化應激是OSAS產生機體損傷的關鍵[8，9]。MDA作為氧化應激的主要指標之一，是脂質過氧化的最終產物[10]。此外，T-AOC和GSH-Px在有效去除內源性過量ROS中發揮重要作用。T-AOC、MDA和GSH-Px可反映機體氧化應激水平及抗氧化系統功能。本實驗結果顯示，與常氧對照組比較，間歇性低氧組血清T-AOC和GSH-Px水平降低，MDA水平升高，提示CIH小鼠體內出現氧化活性物質的堆積、脂質過氧化及氧化-抗氧化系統的失衡，導致氧化應激反應增強。

已有研究發現T2DM患者中合并OSAS的發生率明顯升高，近期研究進一步證實OSAS可導致T2DM的發生[11]，也是T2DM并發癥發生發展的獨立危險因素[12]。本課題組前期的研究結果表明，CIH導致的氧化應激是胰島β細胞氧化損傷的重要機制[13]。研究發現，Nrf2-ARE信號通路是最為重要的內源性抗氧化應激通路。在氧化應激條件下，Nrf2通過從Nrf2-Keap1復合體解離并從細胞質轉移到細胞核中而被激活，然后通過與細胞核中靶基因的ARE序列結合來誘導抗氧化酶和Ⅱ期藥物代謝酶的產生，增強細胞清除活性氧的能力，從而維持氧化還原平衡并減少氧化應激損傷[14]。Nrf2-ARE信號通路已成為治療惡性腫瘤、神經系統疾病、肺纖維化、糖尿病及其并發癥的藥物靶點[15]，然而，其在OSAS中的作用及機制鮮有報道。有研究表明，Nrf2-ARE信號通路在中度至重度OSAS患者中通過抑制炎癥反應、減少氧化應激和誘導解毒酶的表達發揮保護作用[16]。本研究結果顯示，與常氧對照組比較，間歇性低氧組Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS表達降低，這提示CIH導致的氧化應激能抑制抗氧化應激因子Nrf2及其調控的下游抗氧化酶HO-1、NQO1、γ-GCS的表達。本研究還發現，與間歇性低氧組比較，Nrf2激活劑組Nrf2及HO-1、NQO1、γ-GCS表達升高，這表明Nrf2-ARE信號通路可能與抗氧化應激和減輕胰腺組織損傷有關。

EGB是從銀杏葉中分離純化的活性物質，具有強大的抗氧化、清除自由基和抑制脂質過氧化作用，可有效降低氧化應激，減輕炎癥反應。因此，為了研究EGB是否可以通過激活Nrf2-ARE信號通路抑制CIH誘導的胰腺組織損傷，本研究檢測了Nrf2-ARE信號通路相關蛋白的表達變化。研究結果顯示，與間歇性低氧組比較，EGB高濃度組Nrf2的mRNA和蛋白表達增加，EGB中、高濃度組Nrf2-ARE信號通路下游的HO-1、NQO1和γ-GCS的表達均有不同程度增加，這些結果表明EGB在間歇性低氧模型中對胰腺組織的保護作用可能與Nrf2及其下游抗氧化基因的激活有關。本研究還發現，與間歇性低氧組比較，EGB低、中、高濃度組T-AOC和GSH-Px水平增高，MDA水平降低，這表明EGB可以增強抗氧化能力，減輕氧化應激反應，具有抗氧化作用，并與劑量呈正相關。

綜上所述，CIH導致的氧化應激是OSAS胰腺組織損傷的潛在機制，Nrf2-ARE信號通路及其調控的抗氧化蛋白可能通過拮抗氧化應激反應抑制OSAS的胰腺組織損傷。EGB可減輕間歇性低氧小鼠氧化應激水平，上調胰腺組織Nrf2-ARE通路蛋白表達。EGB可能通過減輕氧化應激水平、激活Nrf2-ARE信號通路減輕OSAS胰腺組織損傷。