釀酒酵母異源合成己二酸

張熙，李國輝，周勝虎，毛銀，趙運英*，鄧禹*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

己二酸是一種具有高附加值的化學品，主要被應用于合成尼龍6,6的前體，后者是一種性能優良的紡織材料，可運用在防火系統、宇航制品等先進領域[1]。盡管全球經濟不景氣，己二酸的市場規模保持了每年約3.7%～5%的復合增長率，預計在2019年達到75億美元[2]。目前，己二酸的生產主要以石油來源的環己醇和環己酮為原料[3-4]。在生產過程中，反應條件十分劇烈，并隨著硝酸的氧化作用釋放出大量的氮氧化物，產生巨大的環境壓力[5]。另外，面對日益枯竭的石油資源，己二酸替代生產方案的挖掘勢在必行[6]。2004年，美國能源部發布了一份包含10種“最具價值的生物基化學品名單”，己二酸位列其中[7]。

近年來，微生物代謝工程的發展使低成本、高效率的生物轉化逐漸獲得青睞。在2015年，己二酸首次在重組大腸桿菌中合成，主要使用了內源β-ketoadipyl-CoA thiolase(PaaJ)、來源于Ralstoniaeutropha的 3-hydroxyacyl-CoA reductase(PaaH1)和enoyl-CoA hydratase(Ech)、來源于Euglenagracilis的trans-enoyl-CoA reductase(Ter)、來源于Clostridiumacetobutylicum的 butyryl kinase(Buk1)和phosphate butyryltransferase(Ptb)[8]。然而，這條基于“逆向β-氧化”設計的途徑，產量只有0.6 mg/L；通過一系列基因敲除(ΔldhA, ΔpoxB, Δpta, ΔadhE, ΔsucD)，己二酸的產量被提高到了2.5 g/L[9]。另外，基于其他途徑如逆β-then-ω氧化途徑、2氧代庚二酸途徑、2氧代己二酸途徑、賴氨酸途徑等均被嘗試，并沒有得到良好的效果[10-11]。

鄧禹等[12-13]在T.fuscaB6 突變株中發現了一條可以天然合成己二酸的合成途徑，被命名為Tfu己二酸逆降解途徑。系統分析結果表明，己二酸是由乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A縮合，并經歷5步反應得到——β-ketothiolase(Tfu_0875)、3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase(Tfu_2399)、3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase(Tfu_0067)、5-carboxy-2-pentenoyl-CoA reductase(Tfu_1647)和adipyl-CoA synthetase(Tfu_2576-7)(圖1)。但考慮到T.fusca遺傳背景不清晰、基因操作工具少，該課題組將Tfu己二酸逆降解途徑導入大腸桿菌，并將乳酸、丁酸和乙酸等途徑進行敲除或弱化，以甘油為碳源實現了68 g/L己二酸的產量，為目前已報道的最高值[14]。

圖1 Tfu己二酸逆降解代謝途徑

大腸桿菌等細菌在生產有機酸時需要將pH控制在中性，需要補加大量的堿對發酵環境進行中和，極大地增加了發酵生產成本；另外，在高底物或產物濃度環境中，大腸桿菌等細菌由于其細胞壁結構的原因，耐受性較差，因此在二元羧酸的生產中，釀酒酵母成為了一個更優良的選項。釀酒酵母是一種具有高抗逆性、高酸耐受性和高底物耐受性的真核模式菌株，并以其相對清楚的基因背景，成為有機酸發酵生產中常用宿主。以蘋果酸和丁二酸為代表的二元羧酸均以重組釀酒酵母獲得了較高的產量，分別達到 59和 43 g/L[15-16]。

近年來，在葡萄糖二酸、黏糠酸等高附加值六碳二元羧酸的研究中，酵母也體現出了更加明顯的優勢：本課題組在釀酒酵母平臺中構建葡萄糖二酸生物合成途徑，實現了6 g/L 的目標物產量[17]；LEAVITT等[18]在釀酒酵母平臺中實現了2.1 g/L 黏糠酸的產量。有關己二酸在釀酒酵母平臺的生產報道較少，僅有一個課題組報道：該課題組在LEAVITT等研究的黏糠酸生產菌株的基礎上，加入了微生物 enoate reductases(ERs)，并通過發酵優化由葡萄糖實現了2.59 mg/L 己二酸的產量[19]?；谀壳搬劸平湍钙脚_較低的己二酸產量及細菌類平臺的耐酸性問題，本研究將Tfu己二酸逆降解途徑首次導入釀酒酵母平臺，探索該途徑在釀酒酵母體系中的應用潛力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

本研究中使用的菌株和質粒見表1。

表1 菌株和質粒

1.1.2 培養基

YPD培養基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母抽提物。若需要固體培養基，添加20 g/L 瓊脂粉。

LB培養基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母抽提物, 10 g/L NaCl。若需要固體培養基，添加20 g/L 瓊脂粉。

SD培養基：20 g/L葡萄糖，5 g/L(NH4)2SO4，1.7 g/L YNB，加入適量必需氨基酸。若需要固體培養基，添加20 g/L 瓊脂粉。若需要缺陷型培養基，則再去掉某種缺陷標記氨基酸的添加。

1.1.3 儀器和試劑

PCR儀，美國Bio-red；高效液相色譜儀，美國安捷倫；MALDI SYNAPT Q-TOF MS液相-質譜儀，美國Waters；5 L發酵罐，中國迪必爾；高速冷凍離心機，美國賽默飛；電泳儀，中國六一。

DNA聚合酶Prime Star Max，日本寶生物；DNA連接酶，中國生工；Gibson 組裝試劑，美國NEB；限制性內切酶，日本寶生物；DNA純化試劑盒及質粒小量抽提試劑盒，中國生工。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器和試劑

Tfu己二酸逆降解途徑共涉及5步反應，6個基因，分別為Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0067、Tfu_1647、Tfu_2576、Tfu_2577。從上獲取到基因序列，并在http://sg.idtdna.com/CodonOpt網站上進行密碼子優化，送往蘇州泓訊進行基因合成?；蚝铣稍?個T載體上，得到載體pUCmT-0875-2399、pUCmT-0067-1647和pUCmT-2576-2577，通過引物0875-F/R、2399-F/R、0067-F/R、1647-F/R、2576-F/R、2577-F/R進行擴增后得到基因片段T-0875、T-2399、T-0067、T-1647、T-2576和T-2577，純化后進行下一步實驗。本研究中使用的引物序列見表2。

1.2.2 表達Tfu途徑酶質粒的構建

按順序分別將6個途徑酶基因搭配不同的營養缺陷型標記、啟動子和終止子，得到穿梭質粒P1-V1、P2-V1和P3-V1。以釀酒酵母BY4741的gDNA為模板，用引物CN9847-1-AF/R、CN9847-1-BF/R、CN9847-1-DF/R、CN9847-1-EF/R、CN9847-1-GF/R分別擴增基因片段Tcyc1-1、Ttef1-1、Ptef1-1、Pgpd1-1、Ttdh2-1，與基因片段T-0875、T-2399按照圖2-a順序進行Gibson組裝，各個片段全長連接至T載體，得到中間構建pUCmT-Tfu_0875-Tfu_2399，命名為P1；將中間構建體pUCmT-Tfu_0875-Tfu_2399與質粒pRS423(His)使用XhoI與SacI雙酶切，再用T4DNA連接酶連接得到重組質粒pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399，命名為P1-V1(圖2-b)。以釀酒酵母BY4741的gDNA為模板，用引物CN9847-2-AF/R、CN9847-2-BF/R、CN9847-2-DF/R、CN9847-2-EF/R、CN9847-2-GF/R分別擴增基因片段Ttdh2-2、Tadh1-2、Padh1-2、Ppgk1-2、Tpgk1-2，與基因片段T-0067、T-1647按照圖2-a順序進行Gibson組裝，各個片段全長連接至T載體，得到中間構建體pUCmT-Tfu_0067-Tfu_1647，命名為P2；將中間構建體pUCmT-Tfu_0067-Tfu_1647與質粒pHAC181(Leu)使用NdeI與EcoR I雙酶切，再用T4DNA連接酶連接得到重組質粒pHAC181-Tfu_0067-Tfu_1647，命名為P2-V1(圖2-b)。以獲得的釀酒酵母BY4741的gDNA為模板，用引物CN9847-3-AF/R、CN9847-3-BF/R、CN9847-3-DF/R、CN9847-3-EF/R、CN9847-3-GF/R分別擴增基因片段Tpgk1-3、Ttpi1-3、Ptpi1-3、Ptdh3-3、Tfab1-3，與基因片段T-2576、T-2577按照圖2-a順序進行Gibson組裝，各個片段全長連接至T載體，得到中間構建體pUCmT-Tfu_2576-Tfu_2577，命名為P3；將中間構建體pUCmT-Tfu_2576-Tfu_2577與質粒Y42(Ura3)使用BamH I與EcoR I雙酶切，再用T4DNA連接酶連接得到重組質粒Y42-Tfu_2576-Tfu_2577，命名為P3-V1(圖2-b)。

表2 引物序列

注：下劃線表示同源臂序列

a-途徑構建；b-質粒圖譜

1.2.3 釀酒酵母LSC1基因的敲除

以pUG6質粒為模板，用引物ΔLSC1-pUG6-F/R擴增LoxP-KanMX-LoxP片段；以釀酒酵母gDNA模板，用引物LSC1-Upstream-F/R和LSC1-Downstream-F/R分別擴增LSC1基因上下游500 bp的片段。以OE-PCR方法將上述片段融合，得到LSC1基因敲除框。

以融合得到的敲除框為模板，用引物LSC1-Upstream-F和LSC1-Downstream-R進行PCR擴增，得到高濃度敲除框，純化后轉化釀酒酵母BY4741進行基因敲除篩選。具體的轉化方法如下：將釀酒酵母BY4741活化后，在1 mL YPD液體培養基中培養至對數期(OD600值為0.6～1.0)，5 000 r/min離心得到菌體，用雙蒸水洗2次，并用0.1 mol/L LiAc洗2次，棄上清液，按順序加入240 μL體積分數50% PEG、36 μL 1 mol/L LiAc、20 μL ssDNA(10 mg/mL, 沸水浴5 min)、4 μg 敲除框DNA。在振蕩器混合30 s后置于30 ℃金屬浴1 h，轉移至42 ℃熱激40 min，5 000 r/min離心，用雙蒸水洗2次后涂布YPD-G418平板，培養2～3 d。挑取陽性轉化子提取基因組，用引物ΔLSC1-verify-F/R進行驗證。得到的正確菌株命名為BY4741ΔLSC1。

1.2.4 Tfu途徑釀酒酵母菌株的構建

將構建得到的穿梭質粒P1-V1、P2-V1和P3-V1轉化至BY4741野生型和BY4741ΔLSC1菌株中。具體轉化方法如下：將釀酒酵母BY4741或BY4741ΔLSC1活化后，在1 mL YPD液體培養基中培養過夜，5 000 r/min離心得到菌體，用雙蒸水洗2次，棄上清液，在體系中按順序加入160 μL體積分數50% PEG、50 μL 1 mol/L LiAc、10 μL ssDNA(10 mg/mL, 沸水浴5 min)、20 μL體積分數100% DTT，待轉化質粒各2 μg。在振蕩器混合30 s后置于42 ℃熱激45 min，5 000 r/min離心，用雙蒸水洗2次后涂布SD-Leu-His-Ura平板，培養2～3 d。得到的菌株分別命名為AA-1和AA-3。

1.2.5 Tfu途徑釀酒酵母菌株的發酵和樣品處理

將構建得到的菌株AA-1和AA-3在SD-Leu-His-Ura平板上活化，挑取單菌落轉接至SD-Leu-His-Ura液體培養基培養過夜，按照最終OD600=0.5的接種量接種至YPD液體培養基，30 ℃、250 r/min條件下發酵。每12 h 取樣0.5 mL，樣品經5 000 r/min離心，得到發酵上清液；菌體用雙蒸水洗2次后補齊至EP管0.5 mL刻度線，加入與菌體量相當的玻璃珠，在振蕩器上振蕩1 min，冰浴1 min，循環6次，12 000 r/min離心10 min，上清液即為菌體破碎液。將發酵上清液和菌體破碎液進入后續的高效液相色譜儀或液質聯用儀檢測。

1.2.6 樣品的分析與檢測

液相色譜分析方法：將處理后的發酵樣品，用0.22 μm的濾膜過濾，上HPX-87H有機酸柱(Bio-red)，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速 0.6 mL/min，柱溫30 ℃。

液相質譜分析方法：將處理后的發酵樣品，用0.22 μm的濾膜過濾。質譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm)，檢測器為Waters Acquity PDA detector(200～400 nm)。流動相A，體積分數0.1%甲酸；流動相B，體積分數100% MeOH；流速，0.3 mL/min，梯度洗脫，柱溫，45 ℃。質譜檢測條件：等度洗脫；電噴霧電離正離子源(ESI+)；毛細管電壓3.5 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度100 ℃；去溶劑氣溫度400 ℃；去溶劑氣流速700 L/h；錐孔氣流速50 L/h；電離能量6 eV；MS質量范圍(m/z)20～2 000；檢測器電壓1 800 V。

2 結果與分析

2.1 表達Tfu途徑的菌株構建

通過外源基因和不同啟動子、終止子搭配的方式構建得到的3個重組穿梭質粒，使用驗證引物pRS423-veri-F/R、pHAC181-veri-F/R和Y42-veri-F/R分別進行PCR，得到正確的條帶如圖3所示，PCR產物大小依次為4 936、4 469和4 752 bp。各外源基因均搭配釀酒酵母組常用的成型啟動子，如圖2-a所示。P1-V1、P2-V1、P3-V1質粒均為中高拷貝質粒，可以確?；虻谋磉_量(圖2-b)。將上述經轉化釀酒酵母BY4741得到AA-1菌株。

LSC1基因編碼催化琥珀酰輔酶A轉化為琥珀酸的酶關鍵亞基[20]。通過LSC1基因的敲除，從理論上來講，可以使Tfu途徑的前體物質——琥珀酰輔酶A得以保留；但切斷的TCA循環可能導致菌體生長和代謝的不正常。使用BY4741ΔLSC1菌株基因組為模板進行驗證PCR得到陽性結果，得到正確的BY4741LSC1基因敲除株(圖4)。該菌株經P1-V1、P2-V1、P3-V1質粒的轉化，得到了AA-3菌株(圖2-b)。

M-5 000 bp marker；1-P1-V1驗證；2-P2-V1驗證；3-P3-V1驗證

M-5 000 bp marker；1，2-正確敲除株；3-未正確敲除株；4-空白對照株

2.2 Tfu途徑菌株的發酵驗證

本研究將Tfu己二酸逆降解途徑完整地表達在釀酒酵母AA-1及其LSC1基因敲除株AA-3中，以BY4741野生型菌株作為對照，經過84 h的發酵，分別檢測了生物量、己二酸和乙醇的產量變化(圖5)。

圖5 菌株AA-1、AA-3和BY4741在YPD培養基發酵中生物量的變化趨勢

在生物量變化方面，48 h以前，野生型菌株生長最快，在36 h已接近穩定期，生物量增長放緩；AA-1菌株生長稍顯緩慢，但在48 h生物量達到了11 g/L左右，與野生型相似；AA-3菌株生長緩慢，24 h之后才進入對數期，48 h進入穩定期。但在48 h以后，各菌株生長減緩，生物量峰值接近，為10～12 g/L?？赡艿脑蚴牵?)AA-1菌株含有3個重組質粒，代謝負擔較重，因此生長比野生型稍顯遲緩；2)AA-3為TCA循環切斷菌株，減緩了有氧呼吸速率，因此生物量生長緩慢；3)3株菌最終的生物量達到一致，說明了總碳源氮源相同的情況下，菌體生物量的極值趨于相同。

如圖6所示，在己二酸產量方面，AA-1菌株在24 h 達到了1.12 mg/L，48 h上升到了最大值3.39 mg/L，但在72 h 時發生了下降；令人意外的是AA-3在48 h僅僅檢測到0.33 mg/L己二酸產量，而24 h 和48 h 均未檢測到；野生型沒有檢測到己二酸的生成。己二酸產量在達到最大值后發生下降，可能的原因是己二酸通過該途徑發生了部分降解，該現象與大腸桿菌的報道一致。而AA-3的己二酸產量極少，可能是由于LSC1基因的敲除導致了TCA循環的流量中斷，沒有更多的碳源向積累琥珀酰輔酶A的方向流動。

圖6 菌株AA-1、AA-3和BY4741在YPD培養基發酵中己二酸的產量

如圖7所示，在主要副產物乙醇的產量方面，AA-1和野生型菌株呈現出迅速升高、迅速降低的趨勢；而AA-3則出現迅速升高、緩慢降低的趨勢。在釀酒酵母發酵中，葡萄糖首先通過EMP途徑代謝，為菌體生長提供ATP，而乙醇則作為該途徑的終產物被大量分泌到發酵液中，作為一種未完全氧化的碳源儲備；當葡萄糖等碳源耗盡之后，在有氧條件下，乙醇可以作為第二碳源被重新利用[21]。AA-1菌株和野生型菌株在24 h 生產了約7 g/L乙醇，隨后便開始降低，AA-1的乙醇產量降低幅度更大；相比之下，AA-1的己二酸產量從24 h的 1.12 mg/L大幅升高到 48 h的3.39 mg/L。由以上現象可以推測，部分乙醇可能通過有氧呼吸作用轉化為了己二酸。而AA-3由于TCA循環的中斷，幾乎無法進行乙醇的重新利用，因此在24 h 達到最大產量7.87 g/L后減少緩慢。

圖7 菌株AA-1、AA-3和BY4741在YPD培養基發酵中乙醇的變化

為了對己二酸樣品進行定性，將標準樣品、野生型發酵樣品及AA-1發酵樣品進行液質聯用定性檢測,如圖8所示。

特征離子：83、101、127、145；a-標準品；b-野生型發酵樣品；c-AA-1發酵樣品

己二酸在AA-1樣品中檢測到，特征離子為：83、101、127和145。值得一提的是，本研究僅僅在細胞破碎液中檢測到了己二酸，而在發酵上清液中并未檢測到?？赡艿脑蚴牵?)釀酒酵母細胞壁缺乏己二酸的通道蛋白；2)己二酸總產量較低，無法形成足夠的濃度梯度進行被動運輸。

2.3 Tfu途徑菌株的發酵碳源濃度控制

釀酒酵母具有高產乙醇的特性，這為釀酒酵母作為底盤生物合成高附加值代謝產物造成了一定的阻力：由于葡萄糖或其他碳源大量轉化為乙醇，本應流向異源途徑的代謝流切換到乙醇合成的方向，造成了資源的浪費，降低了目標產物的合成效率。在高糖濃度的情況下，即使在有氧條件下，釀酒酵母會將代謝由呼吸途徑切換至發酵途徑，大量生產乙醇，該現象被稱為“Crabtree效應”[22]；而若將釀酒酵母的乙醇合成途徑相關基因如PDC1、ADH1基因敲除，會導致生長緩慢、代謝異常等現象[23]。從發酵工藝控制角度來看，乙醇的產生是Crabtree效應的具體表現，而促使酵母由呼吸切換至發酵途徑的根本原因是碳源初始濃度。研究表明，隨著碳源濃度的增長，Crabtree效應會愈加明顯[24]。因此適當降低初始碳源的濃度是控制乙醇產量的一種方案。同時，Tfu途徑始于乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，兩者均為有氧呼吸途徑中產生的物質，因此本實驗通過降低初始碳源濃度，降低Crabtree 效應，使酵母有氧呼吸作用增強，減少丙酮酸轉換為乙醇的流量，使更多的碳源通過Tfu途徑轉化為目標產物己二酸。

本研究設置初始碳源質量濃度分別為5、10和 20 g/L，將AA-1菌株發酵48 h測定己二酸、乙醇、生物量等數據，并計算己二酸產率。隨著初始碳源濃度的減少，乙醇產量顯著下降(圖9-a)，但生物量(圖9-b)和己二酸產量(圖9-c)也隨之下降。但己二酸產率則隨著碳源濃度的降低而提高(圖9-d)。

a-乙醇產量；b-生物量；c-己二酸產量；d-己二酸產率

在5 g/L 初始碳源濃度的條件下，己二酸產率比在20 g/L 初始碳源濃度的條件下提高了近1倍，說明初始碳源濃度的降低有助于Crabtree效應的減弱。

3 結論

本研究首次將T.fuscaB6 菌株中己二酸逆降解途徑導入釀酒酵母體系，并實現了己二酸在釀酒酵母宿主中的異源合成。挑選了釀酒酵母內源組成型啟動子、終止子，與6個外源基因進行搭配，成功構建了3個重組質粒并轉化宿主細胞，實現了己二酸的合成。敲除TCA循環關鍵酶基因LSC1并未使己二酸產量獲得提升。通過初始碳源濃度的控制，初步探究了己二酸產率的變化以及對副產物乙醇的控制。AA-1菌株在YPD培養基中發酵，得到了3.39 mg/L己二酸的產量，是同一宿主中報道的最高值。然而，目前該菌株合成己二酸的效率仍然較低。雖然在大腸桿菌中，利用該途徑可以獲得較高的己二酸產量，但在釀酒酵母宿主體系中，菌株合成己二酸的效率仍然較低?？赡艿脑蛉缦拢?)酵母細胞中途徑基因的拷貝數低，導致途徑酶表達量較低；2)酵母細胞中啟動子強度較大腸桿菌相比偏低，導致途徑酶表達量較低；3)碳源大量地流入乙醇及其他副產物的合成途徑，造成己二酸的產量偏低；4)酵母特有的Crabtree效應導致呼吸向發酵代謝的切換，造成了碳源利用效率偏低；5)酵母屬于真核生物，存在線粒體等亞細胞結構，當中進行的TCA循環所產生的己二酸前體代謝物——琥珀酰-CoA可能受到線粒體膜的空間分隔，不容易接觸到胞質中的Tfu途徑酶，造成途徑催化效率低。在今后的研究中，我們將采取增加基因拷貝數、增強關鍵基因啟動子強度、敲除或抑制競爭途徑及發酵工藝優化等策略進一步提高己二酸的生產能力。