德式乳桿菌保加利亞亞種的乳清蛋白利用能力比較

陳嘉琪，崔樹茂，唐鑫，劉小鳴，趙建新，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

德式乳桿菌保加利亞亞種是一種常用于發酵食品生產的乳酸菌。除了產生乳酸外，德式乳桿菌保加利亞亞種還普遍具有良好的蛋白質水解體系[1]，其蛋白水解體系主要包括：將大分子蛋白水解成多肽的胞外蛋白酶、將多肽轉運至胞內的轉運系統、將多肽進一步水解成寡肽或氨基酸的肽酶。氨肽酶是一類從肽鏈的氨基末端水解肽并釋放N端氨基酸的酶，是蛋白代謝的關鍵酶之一，包括特異性較差的金屬氨肽酶PepN和巰基氨肽酶(半胱氨酸氨肽酶)PepC和絲氨酸酶X-脯氨酰二肽氨基肽酶PepX[2-3]。PepN和PepC能夠水解2～12個氨基酸組成的寡肽[4]，但是對含有脯氨酸(Pro)的氨基肽酶底物活性較低；而PepX能夠從富含脯氨酸的乳清蛋白寡肽中釋放X-Pro二肽，其對Gly-Pro-對硝基苯胺(pNA)以及其他X-Pro-pNA底物均具有高活性[5]。

乳清蛋白的主要成分β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)是主要過敏原之一[6-9]。在超過80%的牛乳過敏病例中，β-Lg是兒童和嬰兒牛奶過敏的主要誘因。而人群研究結果表明，牛奶過敏患者中α-La特異性血清免疫球蛋白E的患病率為27.6%～62.8%[10]。已有研究發現，微生物發酵過程中產生的蛋白水解酶具有降解牛奶蛋白過敏原的能力，德式乳桿菌保加利亞亞種可通過水解α-La和β-Lg，有效降低乳清蛋白的過敏性。BU等[11]的研究結果表明，經德氏乳桿菌保加利亞亞種發酵后，乳清蛋白的抗原性顯著降低，α-La和β-Lg的抑制率分別為53%和89%(P<0.05)。此外，保加利亞乳桿菌發酵還可提高α-La和β-Lg的消化率，降低乳清蛋白的抗原性。KLEBER等[9]發現德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌聯合發酵對降低甜乳清和脫脂乳中的β-lg抗原性也非常有效。

雖然前期研究發現了德氏乳桿菌保加利亞亞種在乳清蛋白水解方面的應用潛力，但是尚未闡釋發酵過程中菌株的氨肽酶活力與乳清蛋白水解能力之間的相關性。因此本文選取了8株德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株，檢測其在乳清蛋白培養體系中的3種主要氨肽酶PepN、PepC和PepX活力變化情況，探討不同菌株氨肽酶活力變化與乳清蛋白水解能力之間的相關性，進一步探討應用德式乳桿菌保加利亞亞種制備低致敏性發酵乳清蛋白飲料的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗試劑

WPI(分離乳清蛋白，美國安格普有限公司，貨號LE 007-7-297，主要成分包括蛋白干態(Nx6.38)95.7%，水分4.4%，灰分1.7%，脂肪0.4%，乳糖0.2%)；BCA蛋白濃度測定試劑盒P0010(上海碧云天有限公司)；氨肽酶底物L-賴氨酸-對硝基苯胺(L-Lys-pNA)；H-精氨酸-對硝基苯胺(H-Arg-pNA)；H-甘氨酰-脯氨酸-對硝基苯胺(H-Gly-Pro-pNA)(江蘇吉泰肽業有限公司)；5’-磷酸吡哆醛、苯丙酮酸鈉、對硝基苯胺(阿拉丁試劑有限公司)；MRS培養基、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、1水合α-乳糖、MnSO4·H2O、吐溫80、對氨基苯甲酸、葉酸、L-苯丙氨酸、α-酮戊二酸、EDTA二鈉、乙腈、三氟乙酸(國藥集團化學試劑有限公司)。以上均為分析純。

1.1.2 實驗菌株

實驗所使用的8株德式乳桿菌保加利亞亞種均保存于江南大學食品生物技術中心，其中6株分離篩選自中國青海西寧、四川阿壩及新疆塞鈴木的牦牛酸奶和牦牛曲拉，菌株保藏編號分別為DQHXNS1L2、DQHXNS8L6、DQHXNS15M2、DXJSLMS1M5、DSCAB10M20和D11M188，2株對照菌株編號分別為Lb.2038(分離篩選自日本明治酸奶)和ATCC 11842(購于北納生物有限公司，分離自保加利亞酸奶)。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司；AW500SG厭氧工作站,英國依萊泰科公司；立式自動壓力蒸汽滅菌器GR60DA,廈門致微儀器有限公司；蒸汽滅菌鍋 SX-300,日本Tomy；分析天平,梅特勒-托利多(上海)有限公司；HWS-150恒溫恒濕培養箱,上海森信實驗儀器有限公司；pH計ST3100,常州奧豪斯儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機TGL-16M、臺式高速離心機TG16A,上海盧湘儀離心機儀器有限公司；多功能酶標儀Varioskan LUX,賽默飛世爾科技有限公司；Waters 1525EF高效液相色譜儀,美國沃特世公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養條件

乳清蛋白培養基組成參考LIU等[1]的配方并進行修改。每100 mL乳清蛋白培養基包含4.5 g乳糖、1 g WPI、0.024 g MgSO4、0.003 g MnSO4、0.001 g FeSO4、0.100 g吐溫80、20 μg對氨基苯甲酸和10 μg葉酸。用HCl溶液調節培養基pH分別至6.5、6.0、5.5和5.2后，用0.45 μm的無菌濾膜進行過濾，分裝至5 mL滅菌試管后使用。

1.3.2 發酵過程中生長及產酸速率的測定

接種后的發酵液置于40 ℃培養，于0、3、6、9及12 h取樣測定pH，并進行10 倍稀釋至10-6，MRS平板計數。

1.3.3 無細胞提取液的制備

分別取發酵至0、3、6、9及12 h的樣品，4 000×g，4 ℃ 離心10 min，用50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)重懸并離心，重復3次后將菌體重懸于相同的緩沖液中至終體積為2 mL。采用液氮研磨的方法破碎細胞，將含有菌體的緩沖液振勻后置于研缽中，加入一定體積的液氮不斷研磨，反復凍融3次，之后收集研磨物，12 000×g，4 ℃離心10 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存，備用。

1.3.4 氨肽酶活力的測定

根據STEFANOVIC等[12]的方法，將底物L-Lys-pNA、H-Arg-pNA及H-Gly-Pro-pNA用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)制成1 mmol/L的溶液。96孔板每個孔中加入50 μL底物和50 μL無細胞提取液后，37 ℃孵育30 min，于405 nm處測定吸光值，每個樣品重復測定3次。氨基酸肽酶的活性定義為:單位酶量每分鐘每毫克蛋白釋放對硝基苯胺的量。標準曲線的繪制：配制不同濃度(5～300 μmol/L)的對硝基苯胺溶液，每個濃度取100 μL在 405 nm 測定吸光值，重復測定3次，獲得標準曲線?？瞻讓φ沼镁彌_液代替CFE；蛋白含量用BCA試劑盒平行測定3次。

1.3.5 乳清蛋白利用情況的測定

參考朱鑫鑫等[13]的方法并進行修改。采用反向液相色譜的方法對8株德式乳桿菌保加利亞亞種(以下簡稱保加利亞乳桿菌)水解乳清蛋白主要成分的能力進行分析。(1)樣品預處理:取0、3、6、9及12 h的發酵樣品，6 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液，用0.45 μm的尼龍膜過濾。(2)色譜條件：以Xbridge Peptide BEH C18為色譜柱(300 A，3.5 μm)，檢測波長為215 nm，進樣量為10 μL，流速為0.8 mL/min,柱溫30 ℃，洗脫時間22 min，流動相A為體積分數0.1%的三氟乙酸水溶液，流動相B為體積分數0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，采用梯度洗脫方式。洗脫梯度：0 min：體積分數64%流動相A；2 min：體積分數64%流動相A；7～17 min：體積分數58%流動相A；19 min：體積分數64%流動相A；19～22 min：體積分數64%流動相A。

1.3.6 統計分析及數據處理

本文中所有數據均采用Microsoft excel 2016軟件統計分析，采用Origin 2017軟件繪圖，每個試驗重復3次。

2 結果與討論

2.1 乳清蛋白培養基初始pH對菌株生長能力的影響

為了探討乳清蛋白培養基初始pH對菌株的生長能力的影響，選擇已報道可利用乳清蛋白的Lb.2038分別在初始pH值為6.5、6.0、5.5和5.2四種體系中進行發酵，比較不同條件下菌株的生長和產酸速率的差異性(圖1)。

a-活菌數;b-pH

菌株Lb.2038在不同初始pH的乳清培養基中展示出了差異顯著的生長曲線，從MRS培養基體系接種到營養限制型的乳清蛋白培養基后出現了一段時間的調整期，在0～6 h期間，4種條件下的活菌數均低于初始接種量。培養6 h后，在pH 6.0和pH 5.5條件下的菌株生長速率優于pH 6.5和pH 5.2，12 h后，在pH 6.0和pH 5.5體系下的菌株生長量接近于初始接種量，pH 5.2體系下的活菌數低于初始接種量，而在pH 6.5的培養條件下活菌數持續下降。與本文研究結果一致，LIU等[14]在相似的乳清蛋白培養基中的實驗中也發現，初始pH 5.5時菌株Lb.2038的生長速率較高。初始pH對菌株在乳清蛋白培養基中生長的影響可能與乳清蛋白的構象有關。根據SCAR等[15]的研究結果，當乳清蛋白的pH接近等電點時，蛋白分子間靜電排斥力減弱，會發生結構重排，蛋白的α-螺旋結構降低，表面疏水性增大，—CO與NH—之間的氫鍵被破壞，因此在初始pH 5.5時，菌株對蛋白的水解程度增大，從而有效水解蛋白以維持自身的生長繁殖，表現出比其他3種初始pH值更高的生長量。

初始pH值對菌株產乳酸能力也有影響。在pH 6.5的培養條件下，菌株在0～3 h內迅速產酸，之后隨著活菌數的下降產酸幾乎停滯。在其他3種初始pH值的培養條件下，各菌株的產酸速率大致相仿，初始pH值為6.0時的產酸速率略快于初始pH值為5.5和5.2時的產酸速率?；谝陨蠈嶒灲Y果，本文的后續實驗中均采用初始pH為5.5的乳清蛋白培養基對菌株進行活化與發酵。

2.2 發酵過程中不同菌株的生長情況及產酸速率

8株保加利亞乳桿菌的生長曲線如圖2所示。

a-活菌數;b-OD600

在乳清蛋白培養基中，8株保加利亞乳桿菌的生長對數期均在0～3 h內、3～6 h之后緩慢生長至穩定期，而在MRS培養基[16]或脫脂乳[17]中保加利亞乳桿菌則會經歷4 h的延滯期。這一結果表明，保加利亞乳桿菌在經過同體系活化后，能夠快速利用乳清蛋白。其中，生長量最高的是菌株DQHXNS8L6和DQHXNS15M2，12 h時活菌數分別達到7.50和7.53 lg CFU/mL，而生長量最低的是菌株DXJSLMS1M5和ATCC 11842,12 h時活菌數分別為7.44和7.43 lg CFU/mL。但可能由于營養物質及單一氮源的限制，12 h內8株菌的活菌數增量僅為0.6～0.7個數量級，且菌株間無顯著性差異。OD600測定值表現出相似的生長情況，菌株在3 h內即進入對數期，9 h后到達穩定期。其中，生長速率最快的是DQHXNS8L6和DQHXNS15M2，ΔOD600分別為1.14±0.02和1.17±0.02，而菌株2038僅為0.98±0.03。營養成分不同的乳清蛋白對于菌株的生長能力具有較大影響，PESCUMA等[19]利用含10%蛋白、76.5%乳糖及0.45%鈉鹽的重組乳清蛋白粉對64株乳酸菌的生長進行研究時發現，81%的菌株活菌數增量在6 h內時大于1個數量級，而LIU等[14]利用牛奶中沉淀酪蛋白后的乳清蛋白發酵德式乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌4 h后，菌株的生長量與本文一致。

8株保加利亞乳桿菌的pH變化曲線如圖3所示。其中，pH變化最快的是菌株D11M188和DQHXNS15M2，12 h分別達到0.84±0.08和0.77±0.07，pH下降最慢的是菌株ATCC 11842，12 h pH僅下降0.56±0.12，且其生長能力也較差。相比于在氮源豐富的脫脂乳中部分保加利亞乳桿菌能夠在6 h內pH從6.5下降至5.2～4.7[19]，在乳清蛋白體系中，所有菌株均表現出較低的生長速率和產酸能力。但這一結果仍然表明，保加利亞乳桿菌可以僅利用乳清蛋白進行生長和代謝，這與LIU等[1]的結論一致。

圖3 德式乳桿菌保加利亞亞在乳清蛋白培養基中的pH變化

2.3 發酵過程中不同菌株的3種氨肽酶活力

為了評估8株保加利亞乳桿菌在乳清蛋白培養基發酵過程中的氨肽酶(PepN、PepX、PepC)活力，分別使用含L-Lys-pNA、H-Arg-pNA和H-Gly-Pro-pNA的顯色底物測定保加利亞乳桿菌氨肽酶PepN、PepC和PepX的酶活力水平，結果如圖4所示。

a-PepN;b-PepC;c-PepX

從圖4可以看出，在12 h的發酵過程中，8株保加利亞乳桿菌對3種不同肽酶底物的酶活力和變化趨勢顯示出顯著差異(圖4)。在3 h時菌株DQHXNS8L6和DQHXNS15M2具有最高的3種氨肽酶活力，而其余菌株由于生長速率相對緩慢，此時仍未表現出氨肽酶活性，6 h之后8株菌均具有3種氨肽酶活力且大部分菌株在6 h時3種氨肽酶活力最高。菌株的PepN和PepC酶活力變化趨勢相似，大部分菌株都呈現出先上升后下降的趨勢，而8株保加利亞乳桿菌的PepX酶活力普遍低于PepN和PepC，且不同菌株的變化趨勢差異較大。整個發酵過程中，達到最高PepN酶活力的是菌株DSCAB10M20和D11M188，其PepN酶活力范圍分別為從0～13.49和13.00 nmol 對硝基苯胺/(min·mg蛋白)；達到最高PepC酶活力的是菌株Lb.2038，其PepC酶活力范圍從0～17.17 nmol對硝基苯胺/(min·mg蛋白)；菌株DQHXNS8L6在3 h表現出18.81 nmol對硝基苯胺/(min·mg蛋白)的PepX酶活力，顯著高于其他菌株。比較3種不同的氨肽酶活力，發現除菌株DQHXNS8L6對PepX表現出最高的酶活力外，其余菌株的3種氨肽酶最高活力基本表現為PepC>PepN>PepX，這與MARIE等[5]對瑞士乳桿菌在MRS和脫脂乳培養基的研究結果一致，研究表明菌株對不同底物的酶活力表現為L-Arg-pNA>H-Lys-pNA>H-Gly-Pro-pNA。

2.4 發酵過程中不同菌株的乳清蛋白組分消耗率分析

如圖5所示，8株保加利亞乳桿菌對于乳清蛋白中的4種主要成分具有不同的水解能力。其中，8株菌株對BSA和α-La的水解能力無明顯差異(圖5)，而8株菌株對于β-Lg的利用能力具有顯著的菌株差異性。8菌株對于α-La均具有較強的水解能力，消耗量范圍為26.93%～31.33%，但菌株間無顯著性差異。值得注意的是，8株保加利亞乳桿菌對β-Lg的變異體[20]β-LgA和β-LgB的消耗量范圍分別為10.56%～22.82%和9.04%～23.83%。從3 h起，菌株DQHXNS8L6、DQHXNS15M2和DQHXNS1L2對于β-LgA的利用能力就顯著高于其他菌株。對于β-LgB，菌株DQHXNS8L6、DQHXNS15M2同樣在3 h就表現出較強的水解能力，而菌株ATCC 11842對于β-LgA和β-LgB的水解能力均較弱。實驗結果表明，部分保加利亞乳桿菌具有潛在發酵乳清蛋白的能力。與本文研究結果一致，PESCUMA等[21]發現部分菌株具有更強的蛋白水解能力，他們使用3種不同的乳酸菌水解補充濃縮乳清蛋白的CDM培養基時發現，保加利亞乳桿菌CRL 454比其他菌株更大程度地降解α-La和β-Lg(分別為26%和21%)。

根據實驗結果，8株保加利亞乳桿菌對α-La的水解能力相似，而對β-Lg的水解能力表現出較大的菌株差異性，同時菌株對β-Lg的水解能力與氨肽酶PepN、PepC和PepX酶活力之間存在相關性，在發酵過程前期表現出高氨肽酶活力的菌株對于β-Lg的2種變異體均有較高的水解能力。由于3種氨肽酶底物分別為L-Lys-pNA、H-Arg-pNA和H-Gly-Pro-pNA，α-La序列由146個氨基酸組成，其中PepN和PepC對應的Lys和Arg切割位點分別有12個和1個，PepX對應的X-Pro位點共2個；β-Lg及其前體肽序列由182個氨基酸組成，其中PepN和PepC對應的Lys和Arg切割位點分別有16個和3個，PepX對應的X-Pro位點共8個，β-Lg含有的3種氨肽酶對應的切割位點均多于α-La，而BSA雖然含有較多的3種底物酶切位點，但其在WPI中的含量(3.38%)遠低于β-Lg和α-La，因此PepN、PepC和PepX的酶活力更能反映出β-Lg的水解情況。然而，蛋白水解體系是一個復雜的系統，除了氨肽酶活力外，一方面菌株的胞壁酶活力和多肽轉運系統對菌株的蛋白水解能力具有重要影響[22-23]；另一方面乳清蛋白本身的特性及變性程度也會影響菌株的蛋白利用能力[24]，因此要深入研究保加利亞乳桿菌對于乳清蛋白利用能力的機制仍需結合多方面因素進一步分析。

a-BSA消耗量;b-α-La消耗量;c-β-LgA消耗量;d-β-LgB消耗量;e-菌株DQHXNS15M2和ATCC 11842蛋白消耗量峰面積對比圖

3 結論

實驗結果表明,德式乳桿菌保加利亞亞種在乳清蛋白培養基中最適宜菌株生長的初始pH值是5.5，在該體系中,德式乳桿菌保加利亞亞種能夠在3 h內快速生長到達穩定期。菌株的3種氨肽酶活力(PepN、PepC、PepX)在發酵12 h過程中均表現出先升高后降低的變化趨勢，但不同菌株之間的氨肽酶活力也存在顯著差異性。不同德式乳桿菌保加利亞亞種對于乳清蛋白組分BSA和α-La的水解能力基本相同，但對于β-Lg的水解能力存在明顯的菌株差異性，β-乳球蛋白的變異體A和B的水解范圍分別是10.56%～22.82%和9.04%～23.83%。此外，菌株的氨肽酶活力與β-Lg水解能力之間存在一定相關性，菌株DQHXNS8L6和DQHXNS15M2在3 h即能達到最高的氨肽酶活力并較大程度地水解β-Lg，而其余菌株在6 h時表現出發酵過程中的最高酶活力，這類菌株對于β-Lg的水解能力也相對較弱。

本文基于德式乳桿菌保加利亞亞種在乳清蛋白培養體系的氨肽酶活力及蛋白利用能力進行分析，可篩選出具有較高氨肽酶活力并具有良好α-La和β-Lg利用能力的菌株，對發酵乳清蛋白飲料的研究具有一定價值，但尚需對于不同菌株水解乳清蛋白后的產物分析進行進一步研究。