鎮江香醋陳釀過程中溫度和氧氣對揮發性風味物質的影響

簡東振，周志磊，鞏敏，蔣彰，朱勝虎，李信，韓笑，聶旭東,毛健,5*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)4(江蘇恒順醋業股份有限公司，江蘇 鎮江，212043) 5(國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興，31200)

鎮江香醋以其“色、香、酸、醇、濃”等特點，深受國內外消費者的青睞。陳釀是食醋生產的關鍵步驟，直接影響其風味物質的改變。鎮江香醋通常會放置在有陽光、通風好的地方，經陶壇密封陳釀，在陳釀過程中受貯存環境的影響，發生一系列的物理化學變化，其風味特征也會產生不同程度的改變[1-4]。并且，國外發酵食品的研究中也明確了溫度、氧氣等環境因素對風味品質有明顯的影響[5-6]。

在陳釀過程中溫度和氧氣是影響食醋風味品質的2個重要因素，然而，目前對于鎮江香醋陳釀風味特征的研究中，關于貯存環境影響的研究較少。因此，本實驗通過對食醋的模擬陳釀，采用固相萃取(solid-phase extraction, SPE)和頂空-頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)法結合氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)對不同溫度和氧氣條件下食醋樣品中揮發性風味物質進行檢測，并通過主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)等多元統計分析方法[7-8]進行綜合分析，明確溫度和氧氣對風味物質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食醋樣品：由鎮江恒順醋業有限公司提供。

主要試劑：香氣物質標準品(色譜純)，百靈威試劑公司；C5-C30正構烷烴，Sigma-Aldrich(中國上海)公司；LiChrolutEN固相萃取小柱，德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；Thermo Fisher TRACE 1300氣相色譜儀，配有 ISQ 質譜檢測器，美國賽默飛世爾科技有限公司；2cm 50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司；DF-101KS集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州恒巖儀器有限公司；氮吹儀，上海安譜公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模擬陳釀處理方法

溫度影響：采用預先滅菌處理的50 mL樣品瓶作為貯存容器，裝樣量35 mL。分別取15個食醋樣品放置在25、40和55 ℃的恒溫培養箱中，模擬陳釀5個月。所有樣品不進行充氧操作，每組3個平行。

氧氣影響：食醋樣品在超凈工作臺中溫和充氧30 s，使樣品瓶剩余空間盡可能全部充滿氧氣，充氧方式是采用氧氣罐，通過減壓閥減壓充氧。充氧處理共分3組：不充氧、每月充氧和半月充氧，每組15個食醋樣品，全部放置在40 ℃條件下。每隔1個月進行取樣檢測分析。

1.3.2 預處理方法

SPE：根據文獻[9]的報道方法略加改動。將食醋樣品用超純水稀釋5倍，分別取10 mL稀釋樣品加入20 μL內標(4-甲基-2-戊醇乙醇溶液4.536 g/L)，過0.22 μm水系膜，樣品通過LiChrolut-EN SPE小柱(小柱預先活化：5 mL二氯甲烷、5 mL甲醇和5 mL超純水依次淋洗)后用5 mL超純水沖洗小柱，減壓干燥后使用10 mL二氯甲烷萃取洗脫，無水Na2SO4干燥，最后有機相通過氮吹濃縮至1 mL。

HS-SPME：根據文獻[10]的報道方法略加改動。取5 mL醋樣，2 g NaCl以及50 μL內標(4-甲基-2-戊醇乙醇溶液0.453 6 g/L)加入到15 mL頂空瓶中，密封在60 ℃的恒溫水浴鍋中加熱(平衡10 min，吸附40 min)。

1.3.3 儀器分析方法

GC條件：DB-WAX色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；升溫程序為40 ℃保持2 min，以4 ℃/min升溫至240 ℃保持10 min；載氣為氦氣(>99.999%)，流速1.0 mL/min。

MS條件：電離方式EI；傳輸線溫度和離子源溫度分別為240、280 ℃；質量數掃描范圍33～350 amu。

此外，采用SPE前處理方法，溶劑延遲時間4.5 min，進樣量1 μL；采用HS-SPME前處理方法，進樣口250 ℃下解析6 min。

1.3.4 標準曲線繪制

SPE-GC-MS：準確稱取一定質量的各香氣物質標準品加入到二氯甲烷溶液中配置得到一系列不同濃度梯度的混合標準溶液，將標準溶液進行GC-MS分析，根據目標物與內標物的濃度及響應比繪制標準曲線。

HS-SPME-GC-MS：將食醋中的還原糖和氨基酸的含量按照一定比例配制食醋模擬液，還原糖以葡萄糖計[11-12]。將含有不同濃度混合標準品的食醋模擬液進行GC-MS分析，繪制標準曲線。

1.3.5 定性定量分析

揮發性風味物質定性基于質譜鑒定、香氣物質與標準品保留時間比對和保留指數與文獻中保留指數比對。采用外標標準曲線法對風味物質進行定量。

1.4 數據分析

采用Microsoft Office Excel 2016、Origin Pro 9.0、GraphPad Prism 8.0、R 3.5.2以及SIMCA 14.1軟件等進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 食醋樣品中揮發性風味物質的組成及不同溫度和氧氣對其影響

在食醋樣品中共鑒定了66種揮發性風味物質，包括酸類、醇類、酯類、醛酮類、酚類、含硫類以及雜環類化合物。由圖1可知，溫度和氧氣對風味物質有明顯的影響，大多數風味物質同時受溫度和氧氣的作用，溫度越高，溶氧量越大(半月充氧)，其含量變化越明顯。

A-溫度；B-氧氣；1M-1個月；5M-5個月

2.1.1 溫度對鎮江香醋揮發性風味物質的影響

圖2表明，溫度對酸類和醇類總量的影響較小，而酯類和醛類物質總量受溫度影響較顯著，溫度由25 ℃升高到40 ℃，酯類物質總量明顯減少，這可能是由于高溫加速酯類物質的水解。而高溫對醛類物質生成有促進作用，可能與美拉德反應和醇類物質的氧化有關[13]。此外，溫度對酮類和雜環類物質的總量影響較大(未顯示)，隨著溫度的升高，酮類物質總量有明顯的降低，而雜環類物質總量顯著增加，雜環類物質主要是美拉德反應產生，溫度有利于美拉德反應的進行[14]。

A-酸類；B-醇類；C-酯類；D-醛類

隨著溫度的升高，短鏈脂肪酸如丙酸、丁酸、異丁酸等含量增加，而中長鏈脂肪酸如己酸、辛酸等趨于降低，在葡萄酒研究中也有類似結論[15]。苯乙醇、乙酸乙酯、異丁醛和異戊醛等在高溫條件下含量明顯高于低溫條件下的含量，說明溫度對它們的生成有促進作用。3-羥基-2-丁酮是含量最高的風味物質，受溫度影響顯著(圖3-A)。圖3-B表明，高溫能明顯促進愈創木酚的生成。吡嗪類物質廣泛存在于加熱的食品飲料中，如咖啡[16]，白酒[17]等。2,3,5,6-四甲基吡嗪受溫度影響較大(圖3-C)，溫度升高能促進其含量增加，在食醋中3-羥基-2-丁酮和銨鹽通常被認為是2,3,5,6-四甲基吡嗪的前體物質[18]。葫蘆巴內酯，具有“焦糖香”的香氣特征，被認為是多種酒精飲料的關鍵香氣物質[19-20]，在食醋中首次被檢測定量，高溫有利于葫蘆巴內酯的產生(圖3-D)。

A-3-羥基-2-丁酮；B-愈創木酚；C-2,3,5,6-四甲基吡嗪；D-葫蘆巴內酯

2.1.2 氧氣對鎮江香醋揮發性風味物質的影響

鎮江香醋在陳釀過程中受氧氣因素的影響，半月充氧是加大充氧頻率，增加樣品中溶解氧含量，進而增強氧氣影響效果。如圖4所示，氧氣促進酸類和醛類物質總量的增加，而醇類和酯類物質總量受影響較小。此外，雜環類物質總量隨溶氧量的增大而增加，而含硫類物質總量變化相反。含硫化合物可以通過美拉德反應中含硫氨基酸的Strecker降解或微生物發酵產生[21]，具有極低的香氣閾值和獨特的香氣特征，在食醋中也被鑒定為重要的香氣類別[22]。

A-酸類；B-醇類；C-酯類；D-醛類

由圖5可知，氧氣促進2,3-丁二酮的生成，由于其香氣特征突出，2,3-丁二酮被鑒定為食醋中重要的香氣組分[23]。含硫化合物中，3-甲硫基丙醇隨著溶氧量的增加含量明顯減低。2,3,5,6-四甲基吡嗪以及葫蘆巴內酯等不僅受溫度的影響，氧氣也是重要影響因素。此外，異丁醛和異戊醛是主要的兩種醛類物質，氧氣有利于它們的產生，在黃酒風味特征的研究中也有類似的發現[4]。

A-2,3-丁二酮；B-3-甲硫基丙醇；C-2,3,5,6-四甲基吡嗪；D-葫蘆巴內酯

2.2 基于多元統計方法分析溫度和氧氣對鎮江香醋揮發性風味物質的影響

2.2.1 基于PCA和OPLS-DA分析溫度對揮發性風味物質的影響

對不同溫度條件下食醋樣品結果進行PCA分析，提取3個主成分，累計貢獻率68.7%，基本可以代表樣品的整體信息。PCA結果表明(圖6-A)，55 ℃與25、40 ℃條件下的樣品有明顯的區分。

A1-異戊醇；A2-苯甲醇；A3-苯乙醇；A4-2,3-丁二醇；B1-異丁醛；B2-異戊醛；B3-己醛；B4-苯甲醛；B5-苯乙醛；B6-香草醛；B7-丁香醛；C1-丁酸；C2-戊酸；C3-己酸；C4-辛酸；C5-異丁酸；C6-異戊酸；C7-苯甲酸；C8-丙酸；C9-壬酸；C10-糠酸；D1-乙酸乙酯；D2-乳酸乙酯；D3-丁二酸二乙酯；D4-乙酸苯乙酯；D5-異戊酸乙酯；D6-乙酸異戊酯；D7-己酸乙酯；D8-苯乙酸乙酯；D9-乙酸糠酯；D10-苯甲酸乙酯；D11-甲酸-2-苯乙酯；D12-煙酸乙酯；E1-2,3-丁二酮；E2-3-羥基-2-丁酮；E3-3-乙?；?2-丁酮；F1-愈創木酚；F2-苯酚；G1-二甲基二硫；G2-二甲基三硫；G3-3-甲硫基丙醛；G4-3-甲硫基丙醇；G5-3-甲硫基丙酸；H1-2,4,5-三甲基惡唑；H2-吡嗪；H3-2-甲基吡嗪；H4-2,5-二甲基吡嗪；H5-2,3-二甲基吡嗪；H6-2,3,5-三甲基吡嗪；H7-2,3,5,6-四甲基吡嗪，H8-糠醛；H9-2-乙?；秽?；H10-5-甲基糠醛；H11-r-丁內酯；H12-糠醇；H13-r-己內酯；H14-2(5H)-呋喃酮；H15-麥芽酚；H16-3-乙?；量?；H17-r-壬內酯；H18-2-甲醛吡咯；H19-泛酰內酯；H20-呋喃酮；H21-葫蘆巴內脂；H22-5-乙酰氧基甲基-2-糠醛；H23-5-羥甲基糠醛

在55 ℃高溫長時間陳釀的食醋樣品附近，聚集的主要有2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪，葫蘆巴內酯、5-羥甲基糠醛等一些雜環類化合物以及異丁醛、異戊醛、異丁酸、乙酸乙酯等，表明溫度對這些物質有重要的影響。此外，所有樣品均在95%的置信區間內，因此可以基于PCA進行監督分析，即OPLS-DA。

由圖6-B可知，不同溫度條件下食醋樣品聚類區分明顯，表明溫度能明顯影響食醋的風味特征。對模型進行置換檢驗(200次)，結果顯示未出現過擬合現象，說明該OPLS-DA模型有效。

為了明確溫度對食醋中風味物質的影響，將25和40 ℃樣品分為一組，55℃樣品為另一組，進行OPLS-DA模型分析。通過化合物的變量投影重要性(variable importance in the projection, VIP)以及S-plot分析，選取VIP>1的化合物(對分組貢獻比較大)在S-plot圖上標記，對具有差異性的標志物可視化。

由圖7可知，H23(5-羥甲基糠醛)、H8(糠醛)、E2(3-羥基-2-丁酮)、E1(2,3-丁二酮)和D2(乳酸乙酯)是由溫度引起差異的主要風味物質，表明在食醋陳釀過程中，5-羥甲基糠醛、糠醛、3-羥基-丁酮、2,3-丁二酮、乳酸乙酯等物質的含量受溫度影響較大。

圖7 不同溫度條件下樣品OPLS-DA S-plot圖

2.2.2 基于PCA和OPLS-DA分析氧氣對揮發性風味物質的影響

將不同氧氣條件下食醋樣品進行PCA分析，提取3個主成分，累計貢獻率72.0%。如圖8-A所示，長時間陳釀、溶氧量高的樣品附近聚集著一些吡嗪類物質如2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等以及香草醛、煙酸乙酯、異丁酸等，表明氧氣對其有重要的影響作用。此外，結果顯示所有的樣品均在95%的置信區間內。對樣品進行OPLS-DA分析(圖8-B)可知，不進行充氧與進行充氧操作的食醋樣品有明顯的聚類區分，表明在陳釀過程中，氧氣能明顯影響食醋的風味特征。同時，有效性驗證結果表明模型具有可靠性。

WO2-不充氧；MO2-每月充氧；BO2-半月充氧

將不充氧樣品歸為一組，每月充氧和半月充氧樣品歸為另一組，進行OPLS-DA模型分析。在S-plot圖上標記VIP>1的風味物質。由圖9可知，在陳釀過程中，氧氣能明顯影響E1(2,3-丁二酮)、B1(異丁醛)、B2(異戊醛)、B4(苯甲醛)、C5(異丁酸)、C6(異戊酸)、H8(糠醛)、A1(異戊醇)和G4(3-甲硫基丙醇)的含量變化。

圖9 不同氧氣條件下醋樣分析的OPLS-DA S-plot圖

3 結論

本研究采用SPE和HS-SPME結合GC-MS對陳釀過程中不同溫度和氧氣條件下鎮江香醋揮發性風味物質酸類、醇類、酯類、醛酮類、酚類、含硫類以及雜環類化合物進行定量檢測，并通過PCA和OPLS-DA等多元統計方法對結果進一步分析。結果表明，貯存環境因素溫度和氧氣對食醋揮發性風味物質有顯著的影響，大多數風味物質同時受溫度、氧氣的作用。PCA和OPLS-DA均可對不同處理條件下食醋樣品進行有效的區分，55 ℃和25、40 ℃食醋樣品區分明顯，不充氧和充氧的食醋樣品區分明顯。溫度對5-羥甲基糠醛、糠醛、3-羥基-丁酮、2,3-丁二酮、乳酸乙酯影響顯著，氧氣能明顯影響2,3-丁二酮、異丁醛、異戊醛、苯甲醛、異丁酸、異戊酸、糠醛、異戊醇和3-甲硫基丙醇的含量變化。研究結果表明，食醋在陳釀過程中揮發性風味物質受溫度、氧氣協同作用影響，因此可以通過對溫度和氧氣的控制加速食醋陳釀進程，進而調控食醋風味品質。