石花菜多糖的分離純化及單糖組成分析

裴若楠，翟紅蕾，戚勃，郝淑賢，黃卉，楊賢慶*

1(中國水產科學研究院南海水產研究所，國家水產品加工技術研發中心，農業部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州，510300) 2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

石花菜(Gelidiumamansii)又名海凍菜、雞毛菜，是一種石花菜科(Gelidiaceae)石花菜屬(Gelidium)的海洋經濟紅藻，在日本、韓國以及我國自北到南沿海地帶均有分布[1-3]。作為提取瓊膠的主要原料之一，石花菜在醫藥、生物研究、水產養殖、食品、化妝品等領域被廣泛應用[4-6]。多糖是石花菜中含量最高的成分，也是石花菜中具有重要生物活性的主成分之一，相關研究表明[7-10]，石花菜多糖在降血脂、降血糖、抗病毒、抗炎、免疫調節等方面效果顯著。目前，國內外研究石花菜多糖生物活性的報道較多，但多數研究未對石花菜多糖進行分離純化，仍保留了大量蛋白質、色素等雜質[11-13]。為了更深層次解析石花菜多糖的結構性質及生物活性，對所提粗多糖進行分離純化的研究必不可少。

實驗室前期已對石花菜多糖的提取方法進行了優化，本研究以石花菜為原料，采用優化的復合酶法提取工藝對石花菜多糖進行提取，利用Sevage法對粗多糖中的蛋白質進行脫除，進一步應用DEAE-52纖維素陰離子交換柱聯合Sephadex G-200凝膠過濾層析對所得多糖進行分離純化，對所得高純度多糖的理化性質進行了分析，并通過1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)對多糖進行柱前衍生化處理，采用高效液相色譜技術對其單糖組成進行了測定，以期為石花菜多糖結構解析及功能性產品的研究開發提供初步理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石花菜(Gelidiumamansii)，產自山東威海。

DEAE-52纖維素、Sephadex G-200,合肥博美生物科技有限責任公司；纖維素酶(酶活性≥30 U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活性≥2.0×105U/mg),廣州領馭生物科技有限公司。

14種單糖標準品：D(+)-葡萄糖(glucose, Glu)、D-甘露糖(mannose, Man)、L-鼠李糖(rhamnose, Rha)、D-半乳糖(galactose, Gal)、D-阿拉伯糖(arabinose, Arb)、L(-)-巖藻糖(fucose, Fuc)、木糖(xylose, Xyl)、核糖(ribose, Rib)、氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)、氨基半乳糖(galactosamine, GalN)、古洛糖醛酸(guluronic acid, G)、甘露糖醛酸(mannuronic acid, M)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid, GlcUA)、半乳糖醛酸(galacturonic acid, GalUA)，均購自廣州領馭生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)、無水乙醇、NaCl、苯酚、濃H2SO4、濃HCl、氯仿、正丁醇、三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH等試劑均為國產分析純；乙腈為國產色譜純。

1.2 儀器與設備

UV2550紫外可見分光光度計，日本島津公司；EYELAN-1000旋轉蒸發儀，日本東京理化器械株式會社；Alphal-4冷凍干燥機，德國Christ公司；SUNRISE吸光酶標儀，瑞士TECAN公司；3K30臺式高速冷凍離心機，德國Sigma公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市精達儀器制造廠；Agilent 1100液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；N-EVAP24氮吹儀，美國ORGANOMATION公司；IRAffinity-1紅外光譜儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 石花菜粗多糖的提取工藝流程

將石花菜干藻用自來水浸泡、反復沖洗以去除砂礫及貝殼等雜質，洗凈后的石花菜自然晾曬一段時間后置于55 ℃恒溫干燥箱中鼓風烘干，干燥后用粉碎機粉碎，過80目篩，以無水乙醇作為溶劑，置于恒溫振蕩器中8 h進行脫脂操作。在復合酶[m(木瓜蛋白酶)∶m(纖維素酶)=2∶1]添加量23 g/L、酶解溫度60.5 ℃、料液比1∶32(g∶mL)條件下提取2 h，沸水處理10 min滅酶活力，4 500 r/min離心15 min，取上清液于60 ℃旋蒸濃縮。取濃縮糖液加入1/4體積的Sevage試劑[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]，置于振蕩器中振蕩30 min以脫蛋白，7 500 r/min離心15 min，取上清液重復上述操作至無蛋白沉淀層，離心，取上清液以超純水透析48 h，每隔4 h換水1次，再將透析液旋蒸濃縮至約原體積1/4，加入4倍體積的無水乙醇醇沉過夜，7 500 r/min離心15 min，取沉淀進行冷凍干燥，即得石花菜粗多糖，備用。

1.3.2 石花菜多糖的分離純化

1.3.2.1 DEAE-52陰離子交換柱層析

將DEAE-52填料活化后采用濕法裝柱(1.6 cm×30 cm)，以3倍柱體積的超純水進行平衡。取脫蛋白凍干后的粗多糖樣品100 mg加入20 mL超純水溶解，上樣DEAE-52纖維素柱進行分離純化，按順序依次以超純水及濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，每5 mL收集1管，每個梯度收集60管，以苯酚-H2SO4法[14]隔管檢測洗脫液在490 nm處的吸光度，以管數為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線選取最佳洗脫峰段，按峰對洗脫液進行合并收集，濃縮后經10 000 D透析袋透析48 h，冷凍干燥備用[15]。

1.3.2.2 Sephadex G-200凝膠柱層析

將經DEAE-52離子交換柱分離純化得到的組分GAP1用超純水溶解，上樣于平衡好的Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱(1.6 cm×50 cm)，以超純水進行洗脫，每5 mL收集1管，采用苯酚-H2SO4法逐管檢測洗脫液在490 nm處吸光度，以管數為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線。根據所得洗脫曲線收集主要峰段洗脫液，旋蒸濃縮后冷凍干燥，得精制石花菜多糖。

1.3.3 石花菜多糖單糖組成分析

采用PMP柱前衍生高效液相色譜法[16-19]。

14種單糖混合標準液配制：各單糖的質量濃度均為0.2 mg/mL，置于4 ℃冰箱中備用，使用時先與0.6 mol/L的NaOH溶液按照體積比1∶1混合后再進行衍生化處理。

待測樣品前處理：取GAP1干燥粉末10.0 mg于離心管中，加入2 mL TFA(2 mol/L)，105 ℃條件下水解4 h，氮氣吹干，用甲醇洗滌以除去殘留的TFA，再以氮氣吹干，重復上述操作2次，最后在干燥樣品中加超純水定容至10 mL，得1.0 mg/mL的樣品水解液備用。

PMP衍生化處理：分別取單糖混合標準液及多糖樣品水解液各500 μL于試管中，分別加入500 μL NaOH溶液(0.3 mol/L)，渦旋30 s后加入500 μL PMP-甲醇(0.5 mol/L)，置于水浴鍋中80 ℃水浴1 h，待冷卻后加入500 μL HCl(0.3 mol/L)，混勻后再加入1 mL氯仿渦旋30 s，8 000 r/min離心10 min，吸棄氯仿層，重復上述操作3次，上清液過0.22 μm濾膜，置于4 ℃條件下備用。

色譜條件：色譜柱：Great smart RP18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A相為0.1 mol/L pH 6.85磷酸鹽緩沖液，B相為甲醇，C相為乙腈；梯度洗脫程序：0～9 min，83.0%A、0%B、17.0%C；9～26 min，78%A、0%B、22%C；26～32 min，40%A、0%B、60%C；32～36 min，86%A、0%B、14%C；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；波長：250 nm。

1.3.4 石花菜多糖理化性質分析

1.3.4.1 總糖含量測定

采用苯酚-H2SO4法測定粗多糖、脫蛋白多糖及GAP1的總糖含量。

1.3.4.2 蛋白質含量測定

采用南京建成公司提供的BCA法蛋白濃度定量試劑盒，測定粗多糖、脫蛋白多糖及GAP1的蛋白質含量。

1.3.4.3 糖醛酸含量測定

參照王文平等[20]的方法，采用H2SO4-咔唑法對粗多糖、脫蛋白多糖及GAP1中糖醛酸含量進行測定，方法略有改動：

標準曲線的制作：分別精確吸取半乳糖醛酸標準液(0.1 mg/mL)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞試管中，各加水至1 mL；在冰水浴中向各管加入5 mL的硼砂-H2SO4溶液(0.956 g硼砂溶于200 mL濃H2SO4)，混勻后沸水浴中加熱5 min，取出后冷卻至室溫；再加入0.1%咔唑溶液0.2 mL，渦旋30 s，沸水浴5 min，冷卻測定各管在523 nm處的吸光度。由所得結果建立糖醛酸質量濃度(μg/mL)和吸光度的線性回歸方程為：y=0.007 3x+0.028 9，R2=0.994 9。

多糖樣品中糖醛酸含量測定：取適量粗多糖、脫蛋白多糖及GAP1配制成0.1 mg/mL的樣品液，按照相同方法測定各樣品液在523 nm處的吸光度。對照標準曲線計算糖醛酸含量。

1.3.4.4 硫酸基含量測定

參照宮春宇等[21]的方法，采用BaSO4比濁法測定硫酸基含量，方法略有改動：

標準曲線的制作：取適量K2SO4干燥至恒重，精密稱取108.75 mg，以1 moL/L的HCl溶解定容至100 mL，配制成0.6 mg/mL的硫酸基標準液，置于4 ℃冰箱中備用。

分別吸取0、0.04、0.08、0.12、0.16及0.20 mL標準液于試管中，加入適量1 moL/L的HCl溶液補至0.2 mL，以HCl溶液作為空白，每管分別加入3.8 mL三氯乙酸及1 mL BaCl2-明膠溶液(稱取1 g BaCl2以0.5%的明膠溶液定容至100 mL，4 ℃冰箱備用)，置于室溫下靜置15 min，于360 nm測定吸光度，記為A1；用1.0 mL明膠溶液代替BaCl2，同法測吸光度，記為A2；以硫酸基質量(mg)為橫坐標，吸光度差值A1-A2為縱坐標繪制標準曲線。由所得結果建立硫酸基質量(mg)和吸光度差值的線性回歸方程為y=1.749 4x+0.021 8，R2=0.993 8。

多糖樣品硫酸基含量測定：分別取50 mg石花菜粗多糖、脫蛋白多糖及GAP1于具塞試管中，加入1 mol/L的HCl溶液10 mL，混勻后置于100℃水浴鍋中水解4 h，待水解液冷卻后加入適量HCl溶液定容至50 mL，用濾紙過濾除去不溶物質，即得1 mg/mL的樣品待測液。以同樣方法測定吸光度，對照標準曲線計算樣品液中硫酸基含量。

2 結果與分析

2.1 DEAE-52陰離子交換柱層析結果

通過DEAE-52離子交換層析柱對石花菜多糖進行分離純化，利用苯酚-H2SO4法測定洗脫液490 nm處吸光值，以管數為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線如圖1所示。

圖1 石花菜多糖DEAE-52離子交換柱層析洗脫曲線

從圖1中可以看出，石花菜多糖在經DEAE-52分離后出現4個較為明顯的吸收峰，分別為超純水洗脫組分、0.1 mol/L NaCl洗脫組分、0.3 mol/L NaCl洗脫組分、0.5 mol/L NaCl洗脫組分，其中以0.3 mol/L NaCl洗脫組分含量最高，將其主峰組分收集，命名為GAP1，冷凍干燥后備用。

2.2 Sephadex G-200凝膠柱層析結果

取干燥后的GAP1組分10 mg，加超純水配制成5 mg/mL的多糖樣品液上樣于Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱，以超純水洗脫，每5 mL收集1管，每組分收集30管，苯酚-H2SO4法檢測每管的多糖含量，繪制洗脫曲線如圖2所示。由圖2可知，GAP1組分在經Sephadex G-200凝膠柱后呈現單一對稱的洗脫峰，表明GAP1為單一組分多糖，將主峰組分合并濃縮，冷凍干燥后得白色絮狀精制多糖。

圖2 GAP1在Sephadex G-200凝膠柱中的洗脫曲線

2.3 石花菜多糖的化學組分分析結果

由表1可看出，提取得到的石花菜粗多糖、脫蛋白多糖以及純化后的精制多糖GAP1都為酸性多糖，硫酸基含量及糖醛酸含量都比較高。石花菜多糖在脫蛋白后總糖含量、糖醛酸含量以及硫酸基含量都有一定程度的增加，其中總糖含量增加明顯；蛋白質含量明顯降低，蛋白質脫除率達85.35%，說明Sevage脫蛋白法效果良好；在經DEAE-52及Sephadex G-200分離純化后，精制石花菜多糖GAP1中糖醛酸含量和硫酸基含量進一步增加，總糖含量可達92.56%，且未檢出蛋白質，進一步說明了分離純化操作可更好的去除蛋白質及各種小分子物質，從而提高多糖的純度。

表1 石花菜多糖的化學組分分析 單位：%

注：“—”表示該物質未檢出

2.4 石花菜多糖的化學組分分析結果

由于單糖本身缺乏生色基團，不同單糖之間在結構上又具有一定的相似性，故而通過常規的HPLC檢測方法很難對糖類物質進行高靈敏度的檢測[22-23]，為提高檢測的靈敏度，研究者通常會選擇對糖類物質進行柱前衍生化處理，使其變為具有較強紫外吸收的物質，再經色譜柱進行分離，其中PMP柱前衍生化高效液相色譜法因其具有操作簡便、準確高效、耗時短的特點得到廣泛的應用[24-26]。

采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法對GAP1的單糖組成進行分析，結果如圖3、圖4所示，在保留時間8.863～10.571 min之間為PMP峰。

1-古洛糖醛酸；2-甘露糖醛酸；3-Man；4-Rib；5-Rha；6-GlcN；7-GlcUA；8-GalUA；9-GalN；10-Glu；11-Gal；12-Xyl；13-Arb；14-Fuc(下同)

圖4 GAP1的高效液相色譜圖

由圖3可得各標準單糖的保留時間依次為：古洛糖醛酸 11.220 min，甘露糖醛酸 11.672 min，Man 12.813 min，Rib 14.754 min，Rha 15109 min，GlcN 16.011 min，GlcUA 17.339 min，GalUA 18.620 min，GalN 19.747 min，Glu 20.358 min，Gal 21.797 min，Xyl 22.283 min，Arb 22.658 min，Fuc 24.203 min；從圖4分析可知，GAP1的高效液相色譜圖中顯示出的峰分別對應單糖標準品峰5、7、10、11、12、14，表明GAP1主要是由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和L-巖藻糖組成，其中以半乳糖含量最高，各單糖物質的量比為1.00∶1.00∶4.45∶27.31∶2.27∶1.88。KANG等[12]對石花菜熱水提取物(碳水化合物含量68.54%)中單糖組成進行了測定，結果顯示半乳糖是其水溶性多糖中的主要單糖組分，占其物質的量的86.0%，其次還含有巖藻糖(8.3%)、甘露糖(1.5%)、木糖(1.1%)、鼠李糖和葡萄糖(<1%)及少量葡萄糖醛酸(2.0%)，與本實驗的測定結果在單糖組成類型上是一致的，在單糖組成比例上存在一些差異，可能是多糖的提取純化方法、單糖測定方法不同造成的；CUI等[8]采用GC-MS分析方法，對石花菜同屬的大石花菜(GelidiumpacificumOkamura)純化多糖GPOP-1的單糖組成進行了分析，結果顯示，大石花菜純化多糖GPOP-1主要單糖組成為7.1%木糖、59.7%半乳糖、19.76%半乳糖醛酸，與本實驗測定結果相比，二者單糖組成不完全相同，但二者單糖含量最高的組分都是半乳糖。

3 結論

石花菜粗多糖經過復合酶法提取、多糖溶液加入Sevage試劑[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]脫蛋白后，再依次經過DEAE-52陰離子交換柱、Sephadex G-200凝膠柱進行分離，苯酚-H2SO4法對多糖含量進行測定，對主要的洗脫峰進行收集，得單一組分GAP1。理化性質測定結果顯示：GAP1多糖總糖含量為92.56%，不含蛋白質，糖醛酸質量分數為44.93%，硫酸基質量分數為6.92%，由此結果可以說明，采用DEAE-52陰離子交換柱層析結合Sephadex G-200凝膠柱層析的方法可對石花菜多糖起到良好的分離純化效果。將GAP1組分進行PMP衍生化處理，采用HPLC對多糖衍生物進行分析，通過與混標的單糖標準品色譜圖進行對比分析得出結論，GAP1主要是由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和L-巖藻糖6種單糖按照不同比例縮合而成，其中以半乳糖含量最高，各單糖物質的量比為1.00∶1.00∶4.45∶27.31∶2.27∶1.88。

石花菜廣泛分布于中國沿海，具有重要的經濟價值[27-28]，近年來隨著海洋藥物的發展，對石花菜多糖等海洋藻類多糖的研究也逐漸深入。為進一步探索其生物學功能及作用機理，對石花菜多糖的詳細結構分析，如單糖組成、糖苷鍵連接方式等的研究刻不容緩。本研究對石花菜多糖進行了分離純化，對其理化性質和單糖組成進行了分析，可為石花菜多糖的精細結構解析及進一步的開發利用奠定基礎。