采用分子動力學模擬研究溫度對乳球蛋白穩定性的影響

劉祥雨，覃小麗，鐘金鋒

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

牛乳營養價值高、易于消化且具有諸多保健功能。目前市面上的牛乳制品主要是液態制品和固態制品兩大類，液態奶按殺菌方式又可分為巴氏殺菌奶和超高溫瞬時殺菌奶[1]。牛乳在加工過程中必須經過加熱殺菌以保證奶產品的質量安全，但加熱時發生的一系列物理化學變化，如風味變化、營養物損失和蛋白質變性等[2]，會影響乳制品的感官品質和穩定性，因此在牛乳生產加工過程中，適宜的溫度對于牛乳的品質控制至關重要。

乳蛋白是牛乳中最重要的營養成分，超過60 ℃熱處理就會造成其一定程度的變性，進而形成聚合體，影響乳制品的品質[3]。其中乳球蛋白是乳蛋白的重要成分，其空間結構是通過一些復雜作用力的平衡來維持，高溫會導致空間結構的改變而引起變性。由于乳球蛋白的上述特性，研究其熱穩定性對乳制品加工生產過程具有重要意義。SAKKAS等[4]研究表明液態乳中乳蛋白含量與牛乳加工過程中加熱方式和程度顯著相關。MAYER等[5]研究發現，生乳中乳球蛋白含量為3 261～5 215 mg/L，經過巴氏殺菌后的乳球蛋白含量下降50%，而超高溫瞬時殺菌方式乳球蛋白含量降低90%。然而，上述研究尚未闡明乳品的不同典型加工溫度對乳球蛋白結構的影響程度，無法確定乳球蛋白的變性溫度，導致牛乳加工后乳蛋白含量不足，營養價值下降。目前研究乳球蛋白溫度穩定性的方法主要集中在常規實驗分析手段，還無法獲取蛋白在微觀層面的變化程度。隨著科技發展，借助于分子動力學模擬的技術，有望獲取蛋白分子以及原子水平上的豐富結構信息[6]。目前，借助分子動力學模擬研究蛋白質結構變化的模擬時間通常為10～50 ns[7-10]，對蛋白質熱加工變化程度在分子層面的信息獲取還比較有限，因此，選擇模擬時間為100 ns的分子動力學模擬的方法對乳球蛋白的熱穩定性進行分析，有望獲得較為豐富的蛋白質結構變化信息，為相關生產提供理論指導。

本研究采用分子動力學模擬的方法，研究乳球蛋白在水溶液環境中乳品的不同典型加工溫度(25、45、70、100和120 ℃)對其影響，通過分析乳球蛋白的均方根誤差、均方根波動值、溶劑可及表面積、回旋半徑以及氫鍵等來獲取乳球蛋白的結構變化信息，以期為乳品在典型加工過程中采取適宜加工溫度提供有價值的參考。

1 材料與方法

分子動力學模擬使用GROMACS(version: 2019.03)軟件包[11]，可視化分析采用VMD(version: 1.9.3)軟件[12]。乳球蛋白結構(PDB：3BLG)，從RCSB蛋白質數據庫網站中獲得，對乳球蛋白結構進行除去結晶水和雜質離子預處理[13]。模擬過程使用GROMOS 54A7力場，分子模擬的溫度設置分別為25、45、70、100和120 ℃。在模擬之前，應用周期性邊界條件，制備一個體積為279.12 nm3的水盒子，使乳球蛋白與盒子邊緣最小距離為1 nm，加入SPC水分子來填充水盒子，再加入鈉離子中和體系電荷，以保證正確的滲透壓和靜電中性。使用最陡下降法進行體系能量最小化，然后在25 ℃下對乳球蛋白施加限制勢進行100 ps模擬，使溶劑弛豫。

然后在5種溫度下進行100 ns的分子動力學模擬。使用LINCS算法約束與氫相連的鍵；采用SPME方法計算靜電作用；使用截斷方式計算范德華作用，截斷半徑為1 nm。選用Parrinello-Rahman壓浴方式，Isotropic為控壓方式，使用Velocity-rescale的控溫方式，溫度以20 ℃/ns速率從初始值25 ℃逐漸升至45、70、100和120 ℃，達到目標溫度后系統保持在此溫度下進行剩余的模擬。模擬步長為2 fs，每4 ps儲存一次數據，每個溫度平行模擬2次，用Origin 8.0軟件和xmgrace繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳球蛋白的結構

乳球蛋白主要存在于豬、牛等動物乳汁中，具有重要的營養功能，是乳清蛋白的重要組成部分，分子質量約為18 KDa，約占乳清蛋白總量的50%[14]，如圖1所示。

圖1 乳球蛋白在水盒子里的二級結構VMD圖

乳球蛋白由分子C端上的1個α-螺旋和9個反平行的β-折疊構成，具有由1個8條β-折疊組成的“β-桶”結構中央疏水區域，此結構可以自動結合疏水分子，并對疏水配體具有保護作用，是乳球蛋白最主要的配位結合點[15]。乳球蛋白共有162個氨基酸殘基，主要以穩定的二聚體形式存在，由非共價鍵連接的2個單體組成[16]。

2.2 均方根誤差的分析

均方根誤差(root mean square deviation, RMSD)，是特定時間蛋白質構象與原始結構之間的平均偏差[17]，是衡量體系是否穩定的重要依據。如圖2所示，在25 ℃時，乳球蛋白的RMSD變化程度很小。45 ℃時，乳球蛋白的RMSD值升高，保持在0.25 nm。在70 ℃下，RMSD曲線分為了4個階段。在30 ns之前曲線較為平穩，30～40 ns間RMSD曲線呈現直線上升，結構偏移較大。在40～80 ns之間，RMSD曲折上升，模擬達到80 ns后趨于平穩，RMSD維持在0.45 nm左右。當溫度上升至100 ℃，20 ns內乳球蛋白的RMSD值勻速上升，隨后維持在0.5 nm附近。在120 ℃時，RMSD在40 ns內曲折上升，在40 ns后趨于平穩，保持在0.6 nm左右。此溫度下40 ns的乳球蛋白與33 ns相比，可以看出乳球蛋白的 C端和N端的肽鏈伸直，二級結構β-折疊紊亂，整體結構膨脹。從整體來看，乳球蛋白在5種溫度下，其RMSD值在前40 ns變化比較劇烈，在后60 ns變化相對平緩。在25 ℃時,RMSD有最低值為0.2 nm，在120 ℃時有最大值為0.65 nm。這表明了乳球蛋白結構隨著溫度的上升會發生不同程度的變化。

圖2 溫度對乳球蛋白均方根誤差的影響

2.3 均方根波動值的分析

均方根波動值(root mean square fluctuation, RMSF)，是指某一幀構象相比于平均構象每個氨基酸的均方根位移。由于蛋白質中不同區域有著不同的生物功能，通過觀察殘余物的RMSF值的變化，可以獲取不同溫度下蛋白質的變性程度。如圖3所示，隨著溫度的升高，乳球蛋白殘基RMSF的波動性增大，說明溫度越高對蛋白質的影響越大，蛋白質在高溫下內部分子間會丟失部分作用力，導致天然構象失去穩定性[18]。圖3中每個溫度曲線都顯示出同樣的趨勢，曲線上的峰表示為最易移動的殘余物，殘基Gln35、Glu51和Leu87的RMSF值分別為0.56、0.51和 0.50 nm，相對于其他氨基酸殘基表現出最大的變異。在70 ℃以上，蛋白質的N端和C端的RMSF大幅度上升，120 ℃時RMSF有最大值0.99 nm，這表明乳球蛋白的N端和C端極易受到溫度變化的影響。

圖3 乳球蛋白均方根波動值與殘余物的關系

2.4 溶劑可及表面積的分析

圖4表示了乳球蛋白在5種溫度下親水和疏水區域的溶劑可及表面積隨著時間的變化。從25 ℃升高至120 ℃的過程中，親水區域溶劑可及表面積變化很小，保持在55 nm2左右，疏水區域溶劑可及表面積在逐漸變大，由38 nm2增加到42 nm2。疏水基團和親水基團分別位于乳球蛋白的分子內部和分子表面，由于熱作用使乳球蛋白結構發生了變化，原本的疏水基團暴露在表面，使得疏水區域溶劑可及表面積增加[19]。在模擬過程中，親水區域溶劑可及表面積始終大于疏水區域溶劑可及表面積，所以乳球蛋白表現出親水性大于疏水性的特點，即乳球蛋白在整個模擬過程是水溶性的，高溫沒有改變乳球蛋白的溶解性[20]。與模擬初始相比，總溶劑可及表面積上升10 nm2左右，這說明高溫使乳球蛋白的結構伸展，使疏水基團與水接觸的表面積增加。

圖4 乳球蛋白在25、45、70、100和120 ℃下的溶劑可及表面積

2.5 二級結構變化分析

為了進一步研究溫度對于乳球蛋白穩定性的影響，使用DSSP軟件對乳球蛋白的結構進行分析[21]。乳球蛋白二級結構數量的變化表明了乳球蛋白的整體穩定性和過程發生的動力學[22]。5種溫度下100 ns乳球蛋白二級結構的變化圖如圖5所示?？偠壗Y構的數量隨著溫度的升高而逐漸下降，在70 ℃以上有明顯的數量變化，在120 ℃時變化程度最大，降低了20%左右。不論在哪一種溫度下，β-折疊的數量最多，當溫度升高至70℃后，隨著溫度的升高數量下降25%左右，表示在70 ℃以上部分β-折疊被破壞。α-螺旋和轉角的數量隨著溫度升高而下降，當溫度達到70 ℃以上不再變化，說明α-螺旋和轉角在低溫下已經發生變化。

圖5 乳球蛋白在25、45、70、100和120 ℃的二級結構變化

從圖5可以看出，線圈的數量在較低溫度時上升速度緩慢，在70 ℃以上其數量開始明顯增加，在120 ℃時增加的程度最大，線圈數量由37增加到了59，說明線圈在70 ℃以上易被溫度影響，特別是120 ℃時極大影響了線圈的穩定性。乳球蛋白二級結構中彎曲和3-螺旋的數量在所考察溫度范圍內一直保持在30和5左右，β-鹽橋的數量在0～1之間波動，隨著溫度變化三者變化程度非常小，這表示彎曲、3-螺旋和β-鹽橋對于溫度變化穩定性較高。綜上說明了乳球蛋白的二級結構在70 ℃以上的高溫開始發生變化，引起乳球蛋白的變性，使乳球蛋白結構展開，進而影響乳制品的品質。

2.6 回旋半徑分析

圖6顯示了乳球蛋白的回旋半徑隨著時間的變化情況(45、100 ℃的回旋半徑分別與25、70 ℃相同，此處不予顯示)?；匦霃绞敲枋鋈榍虻鞍捉Y構致密性的物理量，值越小表示乳球蛋白的致密性越大，越大則表示體系越膨脹。如圖6所示，隨著溫度的升高，乳球蛋白回旋半徑值增加。在溫度為25 ℃時，乳球蛋白的回旋半徑隨時間變化很小，穩定在1.50 nm左右。當溫度上升至70 ℃時，乳球蛋白的回旋半徑值比25 ℃增加0.02 nm，此時乳球蛋白有較大的膨脹體系，結構開始發生變化。在120 ℃時，回旋半徑在40 ns前處于較低的水平，40 ns時回旋半徑值升高并維持在1.54 nm左右，此時的乳球蛋白表現出最大的膨脹結構體系，乳球蛋白受到溫度的影響發生變性。這表明在70 ℃以上乳球蛋白發生熱變性，其結構發生不可逆的變化，乳球蛋白結構伸展，整體結構膨脹，導致生物活性的喪失。

圖6 溫度對乳球蛋白回旋半徑的影響

2.7 拉式構象圖分析

拉氏構象圖(ramachandran)是一種使蛋白質結構中主鏈氨基酸殘基的二面角可視化的方法，主要用來鑒定蛋白質的構象是否合理。拉式圖主要分為3個區域：允許區(深色)、最大允許區(淺色區)和不允許區(空白區)。圖7展現了乳球蛋白主鏈氨基酸殘基的二面角在5種不同的模擬溫度下的拉式構象圖。從整體可以看出，隨著溫度的升高，Ramachandran圖也在逐漸變化。在溫度25和45 ℃時，拉式構像圖幾乎沒有變化，蛋白質結構穩定。當溫度升高至70 ℃時，不允許區中的點開始增加，蛋白質結構發生變化。繼續升溫至120 ℃后，與25 ℃的拉式構象圖相比，乳球蛋白結構發生了極大的變化，穩定性下降。這表明隨著溫度的升高，乳球蛋白結構中主鏈氨基酸殘基的二面角在逐漸地變化，乳球蛋白的結構發生了變化，結構穩定性隨著溫度的升高而逐漸減弱。

圖7 在25、45、70、100和120 ℃下乳球蛋白的拉式構象圖

2.8 乳球蛋白氫鍵分析

蛋白質氫鍵是一種非常重要的非共價結構力[23]，是影響蛋白質穩定性的重要因素。隨著溫度的變化，乳球蛋白的結構以及氫鍵的數量和存在方式都會發生變化[24]。圖8顯示，25和120 ℃乳球蛋白分子內的氫鍵數量隨著時間的變化(25、45、70和100 ℃的氫鍵數量幾乎相同，此處只顯示25 ℃的氫鍵數量)，模擬過程中一直發生氫鍵斷裂和新的氫鍵形成。從圖8可以看出，溫度在100 ℃以下的氫鍵數量穩定在125左右。當溫度升高至120 ℃時，80 ns前乳球蛋白氫鍵數量較為穩定，但在80 ns后氫鍵數量先下降后上升，最后氫鍵數量降至100。這說明了氫鍵在100 ℃以下的溫度穩定性較高，120 ℃以上的高溫導致了乳球蛋白結構發生變化，氫鍵數量減少，降低了乳球蛋白的穩定性[25]。

圖8 溫度對乳球蛋白氫鍵數量的影響

2.9 乳球蛋白鹽橋分析

鹽橋是帶電氨基酸殘基之間的相互作用，對蛋白質折疊、結構和功能方面有重要的影響[26]。乳球蛋白內部疏水“β-桶”結構是重要的結合位點，在溫度升高過程中，內部的疏水基團會逐漸暴露出來，乳球蛋白結構趨向松散。通過VMD可視化軟件選擇2個與乳球蛋白內部“β-桶”疏水結構相連的鹽橋，分別為Glu45-Lys70和Glu89-Lys60，它們在溫度為25和120 ℃時的鹽橋距離變化如圖9所示(因其余3個溫度的鹽橋距離與25 ℃時接近，此處只顯示25和120 ℃的距離變化)。鹽橋Glu45-Lys70在25 ℃時距離維持在8～12 ?范圍內，但是當溫度升高至120 ℃時，鹽橋間距離隨著時間而逐漸變大，最終保持在16 ?左右。鹽橋Glu89-Lys60的距離在溫度為25和120 ℃時表現出極大的差別，隨著溫度的升高，鹽橋的距離隨之增大。在溫度為25 ℃時，鹽橋Glu89-Lys60的距離逐漸下降，最終距離為8 ?。當溫度升高至120 ℃，鹽橋距離先下降后上升，最高鹽橋距離可以達到24 ?。這表明了乳球蛋白的鹽橋隨著溫度升高距離逐漸變大，鹽橋破裂，乳球蛋白發生變性，穩定性下降。

圖9 鹽橋Glu45-Lys70(a)和Glu89-Lys60(b)在25與120 ℃的距離變化

2.10 乳球蛋白骨架變化分析

根據VMD可視化軟件得到了乳球蛋白在5種溫度下的骨架構象變化。圖10展示了乳球蛋白在5種模擬溫度下的骨架變化，紅色代表乳球蛋白在模擬初期的狀態，而藍色代表模擬完成后的狀態。

圖10 乳球蛋白在25、45、70、100和120 ℃下的骨架變化

乳球蛋白骨架在5種溫度下都有不同程度的變化。在溫度為25與45 ℃時，初始與模擬后的骨架結構差別不大，模擬完成后乳球蛋白仍能保持原有的結構。當溫度升高至70 ℃時，與初始結構相比，模擬結束后的骨架結構表現出輕微的膨脹，這與回旋半徑得出的結果一致。在溫度為100 ℃的骨架變化中，模擬后的骨架表現出更大的膨脹，此時骨架與初始骨架結構相比有輕微的變化。當溫度繼續升高至120 ℃時，此時模擬后的乳球蛋白的骨架結構與初始相比有更大的變化，“β-桶”結構變成無序狀態，整體結構伸展。通過初始與模擬后骨架圖可以觀察到乳球蛋白在不同溫度下的變化程度。這說明了乳球蛋白在高溫下，尤其是在120 ℃的高溫下，蛋白質的結構發生改變，導致蛋白質變性，降低了乳球蛋白的營養價值和活性。

2.11 乳球蛋白性質分析

乳球蛋白不僅營養價值豐富且具有優良的功能性質，在一定的溫度下乳球蛋白的結構發生改變，進而引起其性質的變化。近年來，不同熱處理溫度牛乳中乳球蛋白性質研究總結如表1所示。從表1可以看出，由于在加熱過程中蛋白質發生了變性導致聚集和沉降[27]，乳球蛋白的含量和溶解度隨著溫度的升高而下降，在100 ℃已經有91%以上的乳球蛋白發生變性。乳球蛋白經過60 ℃加熱后較常溫的乳球蛋白的乳化性低75.55 m2/g，這是由于加熱導致乳球蛋白聚合親水性下降進而引起乳球蛋白乳化性降低[28]。RAHAMAN等[29]使用ANS作為熒光探針并用熒光法測定乳球蛋白表面疏水性，發現高溫使乳球蛋白內部疏水基團暴露，乳球蛋白的表面疏水性隨著溫度升高而增大，并在100 ℃時增大至常溫的2倍。乳球蛋白結構和生理功能的改變說明了乳球蛋白在70 ℃時開始發生變性，并隨著溫度的升高變性的程度增大。上述研究結果在一定程度上，與本文中采用的分子動力學模擬分析得出結論相一致。

表1 不同熱處理溫度下牛乳中乳球蛋白功能性質的變化

注：常溫，25 ℃;“-”表示無此實驗條件下數據

3 結論

本文采用了分子動力模擬的方法研究并分析了乳球蛋白在5種溫度(25、45、70、100和120 ℃)下的結構變化，乳球蛋白在低于70 ℃時，結構比較穩定。但當溫度升高至70 ℃后，乳球蛋白的結構發生變化，主要表現在RMSD和RMSF值顯著增加，回旋半徑值增大，疏水基團暴露，導致疏水區域溶劑可及表面積增加了15 nm2，乳球蛋白內部氫鍵數量減少25個左右，鹽橋間的距離增大。同時乳球蛋白的二級結構也隨著溫度的上升發生不同的變化，乳球蛋白結構被明顯破壞，特別是在120 ℃的高溫下，乳球蛋白發生了極大的變性，破壞了乳球蛋白的活性。