BMP9介導多種干細胞成骨分化的研究進展

龍國賡，程嬌，蔣練

(1.遵義醫科大學研究生院，貴州 遵義 563000； 2.遵義醫科大學附屬口腔醫院頜面外科，貴州 遵義 563000)

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，在骨骼發育、骨形成和干細胞分化中發揮著重要作用[1]。目前已鑒定出20多種BMPs，影響著整個人體的組織結構[2-3]。BMP9因其強大的成骨能力在近年來逐漸被關注。間充質干細胞(mesenchymal sterm cells，MSCs)是具有自我更新能力的多功能干細胞，在干細胞生物學和再生醫學領域被廣泛關注。成骨細胞MSCs的分化是一個嚴格調控的序列事件，包括骨和骨骼發育過程中發生的大多數分子過程，而成骨分化由許多途徑調節[4-5]。MSCs在再生醫學、組織修復及其他細胞療法中的臨床應用越來越受到關注，已從各種來源中分離出MSCs，如骨髓、脂肪組織、臍帶組織、牙周韌帶、滑膜、經血和牙髓等[6-10]。盡管骨髓是最早發現的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的來源，但BMSCs的使用受到一些因素(如侵入性手術和隨后出現的患者不適)的限制。因此，骨髓以外MSCs的來源已被積極探索，且有必要定義關鍵通路的具體機制以及不同信號通路之間的相互作用?，F就BMP9介導多種干細胞成骨分化作用的研究進展予以綜述。

1 BMP9經典信號通路對干細胞成骨分化的作用

1.1Smad通路 哺乳動物BMP受體包括7種Ⅰ類受體[激活素受體樣激酶(acticin receptor like kinase，ALK)1～7]和激活素Ve型Ⅱ受體[包括激活素受體ⅡA、激活素受體ⅡB、BMP受體Ⅱ、TGF-β受體Ⅱ和抗苗勒管激素受體Ⅱ]，當BMP與Ⅱ型受體結合時，BMP信號被激活，Ⅰ型受體被磷酸化，從而激活受體活化型Smad(R-Smad)蛋白；在細胞質中，R-Smad與共同通路型Smad(co-Smad)結合，并轉移到細胞核中以調節靶基因的表達[11-12]。BMP/Smad是介導BMP9成骨活性的經典信號通路[13]。BMP介導的信號轉導與特異性細胞表面受體激酶結合后，磷酸化的轉錄因子Smad1/5/8與核內Smad4形成異二聚體復合物，激活靶基因的轉錄，有研究證明，與其他成骨BMP一樣，BMP9能促進Smad1/5/8的激活[14]。此外，Smad的激活是BMP9介導的小鼠胚胎來源的MSCs(C3H10T1/2)成骨分化所必需的，在BMP9處理的C3H10T1/2細胞中，磷酸化Smad1/5/8的水平同時升高，表明BMP9確實激活了Smad通路；相反，RNA干擾被用來沉默Smad4，減少了Smad1/5/8的核易位，破壞了BMP9誘導的成骨分化，阻止了C3H10T1/2細胞向成骨分化[15]。此外，RNA干擾剔除了Smad4，可抑制BMP9誘導的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性和鈣沉積，提示Smad信號在BMP9誘導的MSCs成骨分化中起重要作用[16]。

1.2促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路 MAPK是調節基因表達、有絲分裂、代謝、運動、存活、凋亡及分化的關鍵蛋白激酶。在哺乳動物中已鑒定出4個以上的MAPK亞家族，包括胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)1/2、ERK5、c-Jun氨基端激酶和p38 MAPK[17]。BMP9誘導成骨分化的機制受到越來越多的關注，除經典的BMPs信號通路外，一些非經典途徑及其他通路也受到越來越多的關注，其中MAPK通路研究最多[18]。p38 MAPK通路是MAPK信號通路中的一條經典途徑。BMP9可以激活MAPK(p38和ERK1/2)信號通路，但p38和ERK1/2調控BMP9誘導的MSCs成骨分化的作用相反，即抑制p38可降低BMP9誘導的成骨分化，而抑制ERK1/2可刺激BMP9誘導的成骨分化[19]。蔣琳等[20]的研究表明，與BMP2和BMP7相比，BMP9誘導牙周膜干細胞成骨分化的作用更強。張奕等[21]的研究表明，BMP9對人牙周膜干細胞具有誘導成骨分化的能力；同時，p38 MAPK通路在參與該過程的基礎上，對BMP9-人牙周膜干細胞成骨分化也具有正向調節作用，為牙周組織再生成骨分化調控提供了理論基礎。但該實驗為體外實驗，更深入的體內調控機制尚需進一步研究。牙周組織再生是近年來研究的熱點與難點，其中最關鍵的是牙槽骨再生[22]。牙周組織再生中首先要解決種子細胞的問題，具有高度增殖、自我更新能力和多向分化潛能的牙周膜干細胞已成為牙周組織再生最理想的種子細胞[23]。

1.3Wnt/β聯蛋白(β-catenin)信號通路 典型的Wnt信號通路由β-catenin介導，Wnts是一類在骨骼發育和成骨細胞分化中起關鍵作用的分泌蛋白[24]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的中心靶蛋白，是Wnt/β-catenin信號通路的重要組成部分，Wnt/β-catenin信號通路對于正常的骨的形成和發育至關重要[25]。BMP9可誘導BMSCs的成骨分化，當Wnt/β-catenin信號被抑制時，其成骨分化能力顯著降低；另外，BMP9信號與Wnt信號途徑存在廣泛的交叉作用[26]。He等[27]研究表明，高磷能夠激活Wnt/β-catenin通路，而BMP9在血管平滑肌細胞中也表現出同樣的激活作用，因此，Wnt/β-catenin通路可能在一定程度上介導BMP9誘導的血管平滑肌細胞鈣化。Zhang等[28]研究發現，BMP9和Wnt3a可能協同誘導小鼠的牙尖干細胞形成異位骨。這些結果均提示，β-catenin信號通路可能在BMP9誘導的成骨/牙源性信號轉導中起重要作用，BMP9和Wnt3a可能協同誘導牙尖干細胞向成骨/成牙本質細胞分化，這可能與β-catenin信號轉導功能有關。因此，BMP9和(或)Wnt3a有望成為牙源性再生和牙齒工程新的、有效的重要生物因子。在骨折修復的早期階段，β-catenin是多能間充質細胞分化為成骨細胞或軟骨細胞的必要條件，而在修復后期，β-catenin則是骨祖細胞分化為成骨細胞的必要條件[29]。正在開發的抗硬皮病蛋白抗體等治療方法，不僅可以促進骨形成，而且有望扭轉由于骨質疏松造成的有害骨丟失[30-31]。

1.4Notch通路 哺乳動物有4種Notch受體(Notch1～4)和5種Notch配體(Delta-like 1，3，4、Jagged1和Jagged2)。Notch信號通過相鄰細胞Notch配體與受體的相互作用產生，Notch蛋白經過3次剪切，由胞內段(notch intracellular domain，NICD)釋放入胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL(CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱)結合，形成NICD/CSL轉錄激活復合體[32]。文獻表明，Notch信號在成骨分化中的作用是矛盾的，但其在調節BMP誘導的MSCs成骨分化中起關鍵作用[33]。Wang等[34]的研究表明，Notch和BMP通路之間存在著直接的調節關系，原癌基因JunB可能是這兩條通路之間的匯合點。JunB可能是一個新的靶點，通過激活Notch信號抑制BMP/Smad信號誘導的MSCs成骨分化。已有研究表明，JunB是骨發育的必需基因[35-36]。由于成骨分化通常與成脂過程有關，因此在體外和體內均檢測到了相關的成脂指標[37]。這些結果表明，NICD不僅抑制了MSCs的成骨分化，還抑制了MSCs的成脂過程。組織學染色顯示，NICD對骨基質、脂滴和軟骨基質的形成有顯著的抑制作用，提示NICD不僅可抑制MSCs的成骨分化，還可抑制MSCs的成脂和軟骨分化[38]。這一結果表明C3H10T1/2多能干細胞向脂肪細胞的分化需要非經典BMP信號通路[39]。另外，Notch信號通路具有促進細胞增殖和維持MSCs自我更新的能力。這一結果說明了NICD對BMP9誘導成骨分化的負面影響。Yan等[40]研究發現，ALK2的表達在Notch上調后顯著增加，當Notch下調時，ALK2的表達降低，但其他BMP受體則無變化；經重組腺病毒顯性負性突變型受體ALK2處理后，BMP9誘導的MSCs成骨分化明顯受到抑制，但這種抑制作用被Notch配體Ad-DLL1(adenovirus-delta-like 1)抑制，表明Notch對BMP9/Smad信號轉導的影響可能是通過上調MSCs中的ALK2來介導的。

2 BMP9與其他途徑協同對干細胞成骨分化的作用

2.1胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)信號通路 IGF-1/IGF-1受體信號是IGF家族的主要信號轉導途徑。配體激活IGF-1受體可導致磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和Raf/ERK兩條主要的信號通路激活，調節細胞的生長、增殖和分化[41]。Jiang等[42]的研究表明，IGF-1可以部分逆轉地塞米松對BMP9誘導的成骨抑制作用。IGF-1可能通過PI3K/Akt途徑上調環加氧酶(cyclooxygenase，COX)-2的表達，從而發揮逆轉作用，但確切機制還有待進一步研究。IGF-1在預防骨質疏松方面的研究，為尋找新型抗骨質疏松藥物提供了新的方向。Chen等[43]利用重組腺病毒發現，IGF-1增強了BMP9在C3H10T1/2細胞中誘導的ALP活性和基質礦化；體內實驗顯示，BMP9聯合IGF-1治療組的骨體積和成熟度均大于單獨治療組。IGF-1可以增強骨髓基質細胞中BMP9誘導的BMP/Smad信號的激活，說明IGF-1是BMP9誘導的MSCs成骨分化的一個很好的候選增強劑，這可能是通過促進BMP9啟動BMP/Smad信號轉導的激活介導的。

2.2Akt通路 PI3K是一類催化肌醇與磷脂酰肌醇的脂質激酶，根據其結構特性分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類，研究最為廣泛的是Ⅰ類PI3K。某些信號因子激活Ⅰ類PI3K，產生細胞內重要的第二信使磷脂酰肌醇 4，5-二磷酸和磷脂酰肌醇 3，4，5-三磷酸，再與Akt結合，促進級聯反應繼續傳遞[44]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，處于PI3K/Akt途徑的中心環節。Chen等[45]已經證明，在小鼠間充質基質細胞中BMP9介導的成骨細胞分化需要PI3K介導?；|細胞衍生因子1(stroma cell derived factor 1，SDF-1)在干細胞/祖細胞(如MSCs)向損傷部位生長的過程中起重要作用，研究發現，牙周膜成纖維細胞分泌SDF-1，而BMP9能促進人MSCs分泌SDF-1[46-47]。Furue等[48]的實驗表明，PI3K特異性抑制劑LY294002不僅可抑制BMP9增強的ALP活性，而且可抑制BMP反應基因和成骨標記基因的表達；此外，LY294002還抑制了BMP9上調的SDF-1的產生。由此認為，BMP9通過PI3K/Akt途徑促進牙周膜成纖維細胞的成骨分化和SDF-1的產生。

3 BMP9成骨調控因子對干細胞成骨分化的作用

3.1缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1 HIF-1是骨骼發育等多種發育過程中血管生成的調節因子。Hu等[49]研究了HIF-1α介導的血管生成信號對BMP9調控的MSCs成骨分化的影響，發現BMP9通過Smad1/5/8信號通路直接誘導MSCs中HIF-1α的表達，外源性HIF-1α的表達與BMP9誘導的MSCs成骨分化有協同作用；相反，小干擾RNA介導的HIF-1α沉默或HIF-1α抑制劑對BMP9誘導的MSCs成骨信號有顯著的抑制作用。在骨骼系統發育過程中，缺氧和HIF-1驅動的信號參與軟骨內骨形成[50]。Drouin等[51]采用定量聚合酶鏈反應研究了幾種成骨性BMP(BMP2、BMP7和BMP9)在常氧孵育或缺氧培養24 h細胞中肌間質細胞(muscle resident stromal cells，MRSCs)的表達情況，結果發現，缺氧和常氧孵育條件下細胞中BMP2和BMP7信使RNA的表達水平相似，缺氧可顯著促進BMP9信使RNA的表達；蛋白質印跡法分析顯示，在正常培養條件下培養的MRSCs中未檢測到BMP9蛋白，而缺氧培養24 h后，在MRSCs中檢測到BMP9，5 d后檢測到較高水平BMP9，說明缺氧可誘導MRSCs產生內源性BMP9。氧參與許多生理和病理過程，通過促進MRSCs的激活和增殖，以增加MRSCs成骨的能力。這種作用可能通過激活Smad通路以及促進MRSCs表達BMP9來實現，為缺氧異位骨化的研究提供了理論基礎，但具體機制還有待進一步研究。

3.2COX COX是一種將花生四烯酸轉化為前列腺素的限速酶。COX的3個轉錄變異體分別為COX-1、COX-2和COX-3，其中只有COX-2在骨代謝中起重要作用，包括骨再生和骨折愈合，COX-2可促進BMSCs的成骨譜系，并上調成骨標志物；此外，COX-2的表達減少或沉默會延遲骨折愈合[52]。Wang等[53]研究發現，使用含不同濃度COX-2特異性抑制劑NS-398處理細胞，可顯著降低BMP9誘導的ALP活性，且呈濃度依賴性；進一步分析發現，BMP9處理組Runx2和DLx-5(distal-less homeobox gene 5)的表達均顯著增加，但與COX-2基因剔除結合后表達減弱；然而，Runx2和DLx-5的表達減弱被外源性COX-2表達所逆轉，同時，BMP9上調的Smad6和Smad7信使RNA的表達在COX-2被剔除時也受到抑制。這些證據支持COX-2能調控BMP/Smad信號轉導，但具體機制尚不清楚，COX-2可能與BMP9形成調節環，調控BMP9啟動的BMP/Smad信號轉導及BMP9的表達。He等[27]利用COX-2和BMP9存在陽性環的表達設計實驗，結果顯示，COX-2可能通過部分激活Wnt/β-catenin通路促進BMP9誘導的血管平滑肌細胞鈣化，為血管鈣化的防治提供了新的靶點。

3.3局灶黏附激酶(focal adhesion kinase，FAK) FAK又稱蛋白酪氨酸激酶2，是一種酪氨酸激酶，在整合素介導的信號轉導途徑中起重要作用[54]。人體脂肪組織含有一種可能分化為多個譜系的細胞亞型，這種細胞被稱為脂肪源性干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)[55]。ADSCs與MSCs相似，在適當刺激下可發揮成骨分化作用，促進骨再生，因此研究 ADSCs的成骨調控具有重要意義。Yuan等[56]的研究顯示，BMP9處理的ADSCs含有更強的FAK磷酸化和成骨基因表達，當細胞接受較高劑量的BMP9時，ALP、骨橋蛋白、Runx、FAK的強度均會增加；BMP9誘導的ALP和磷酸化FAK信號表明BMP9與ADSC成骨作用具有很強的相關性，而BMP9的作用也增強了FAK的激活，該研究通過Wnt信號通路揭示了FAK-BMP的相互作用，表明FAK可以作為BMP9的下游因子。Zheng等[57]研究發現，BMP9能促進體外滑膜MSCs的增殖、遷移和成骨分化，而小干擾RNA誘導的FAK基因剔除可顯著逆轉BMP9細胞增殖、遷移和成骨分化，FAK基因剔除能有效抑制BMP9誘導的骨形成，其機制可能與激活Wnt和MAPK途徑有關。這些發現為成骨分化和ADSCs、滑膜MSCs的研究，特別是骨再生的研究提供了有力的支持，具有巨大的治療潛力。

3.4血紅素加氧酶(heme oxygenase，Hmox)1 Hmox是一種廣泛存在于人類和哺乳動物中的微粒體酶。Hmox以3種同工酶形式存在，即Hmox1、Hmox2和Hmox3。Hmox1在骨折修復過程中可增強MSCs的成骨細胞分化[58]，提示Hmox1在骨發育和成骨分化中發揮作用。另一方面，Hmox1也可能調節脂肪代謝，如Hmox1上調可減輕喂食高果糖飲食小鼠脂肪細胞的功能障礙和肥胖[59]。BMP9誘導的BMSCs向成骨和成脂的分化是相互排斥的[60]。因此，解讀Hmox1、BMP9作用下誘導MSCs向成骨/成脂分化的調控機制可能有助于了解骨骼疾病(如骨質疏松癥)和脂肪疾病(如肥胖)。盡管Hmox1在成骨中的確切作用尚存在爭議，但Hmox1可能在脂肪生成中發揮抑制作用[61-62]。Liu等[63]發現，BMP9能促進β-catenin蛋白總量增加，且在Hmox1處理后β-catenin蛋白水平進一步增加。這些結果提示β-catenin可能是BMP9誘導MSCs Hmox1相關成骨分化和成脂分化的關鍵調節因子。Hmox1可能通過調節p38、ERK1/2、Akt、Wnt/β-catenin等多種信號通路，增強BMP9誘導的成骨分化，并減弱BMP9誘導的脂肪分化。

4 小 結

BMP9不僅在骨發育和修復再生中起關鍵作用，而且參與調節胚胎發育和器官發生，并調節各種組織細胞的生長、發育、凋亡、遷移和侵襲等。BMP9介導了多種MSCs成骨分化的作用。雖然目前對BMP9介導的部分信號通路的作用仍存在爭議，但隨著相關實驗研究的不斷深入，一定會進一步明確其作用機制，而在這個過程中可能會涉及新的轉換平衡。闡明BMP9介導的成骨機制并使其轉化到臨床應用中，有助于開發更好的治療方法。深入了解BMP9介導下成骨信號通路與MSCs之間的成骨機制，可能為臨床運用多種干細胞治療相關疾病提供新的思路。