GPC3在不同侵襲能力肝細胞癌細胞株中的表達及其與4E-BP1和PS6K的相關性研究

高飛，董勤

(1.內蒙古醫科大學，呼和浩特 010110； 2.內蒙古醫科大學附屬醫院肝膽外科，呼和浩特010030)

肝癌是常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率和死亡率均居首位[1]。而肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發病率在肝臟腫瘤中又居首位，5年以上生存率約為10%[2]。目前HCC以手術配合放化療的綜合治療為主，然而60%～70%的HCC患者在手術切除的5年內會再次復發，甚至發生轉移，一旦轉移則更難以治療。因此，探索肝癌的發病機制及轉移復發的相關因素，并找到預測轉移復發的生物指標和藥物靶向治療的靶點，是目前腫瘤學研究的熱點之一。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(phosphatidylinositol proteoglycan 3，GPC3)是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路的上游分子，通過mTOR信號通路對細胞的生長起正向調節作用，核糖體S6蛋白激酶1(ribosomal S6 protein kinase，PS6K)和真核細胞啟動因子4E結合蛋白1(promoter 4E-binding protein 1，4E-BP1)是mTOR下游底物，對細胞的生長起負向調節作用。在肝癌細胞中GPC3、4E-BP1及PS6K的表達及其與癌細胞侵襲能力相關性的研究較少，是否可以作為預測轉移復發的分子標志物也未見探討。因此，本研究利用蛋白免疫印跡法(Western blotting)和定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)方法對GPC3、4E-BP1和PS6K在不同侵襲能力的HCC細胞系中的mRNA和蛋白表達進行檢測，并通過生物信息學分析數據的相關性，探討這3項指標在HCC的診斷、預測轉移復發及HCC發生發展中的價值。

1 材料與方法

1.1材料 總RNA快速提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、qPCR試劑realMaster Mix(SYBR Green)均購自天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物合成于美國Invitrogen公司；兔源的抗GPC3抗體(1∶1 000)，抗4E-BP1抗體(1∶1 000)，抗PS6K抗體(1∶1 000)，抗β-Actin抗體(1∶1 000)，辣根過氧化物酶標的抗兔二抗(1∶1 000)均購自美國Abcam公司；HL-7702、MHCC97H、MHCC97L細胞系購自美國ATCC公司，RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute Media 1640)和DMEM(Dulbecco′s modified eagle medium)細胞培養基和胎牛血清(10099141)購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素和胰酶購自北京索萊寶科技有限公司，絲氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(36978)購自美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析 利用在線網站cbioportal和GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)輸入基因名稱，限定在HCC條目中搜索，分別查找GPC3、4E-BP1和PS6K基因在HCC患者組織中的表達及其與預后的關系。

1.2.2細胞培養 使用10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養基培養HL-7702、MHCC97H、MHCC97L三種細胞，并置于37 ℃、5% CO2培養箱中長期培養。觀察細胞生長狀況，當細胞匯合度達到約90%時進行消化、傳代。接種合適的細胞數量至孔板中繼續培養，用以進行后續實驗。

1.2.3Western boltting檢測 分別收集孔板中的HL-7702、MHCC97H、MHCC97L細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖溶液洗滌兩次，將消化下來的細胞用含有 0.1 mmol/L絲氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制劑和蛋白酶抑制cocktail(4693116001，Roche)的細胞裂解液[成分包括50 mmol/L 3-羥甲基-氨基甲烷-鹽酸，1%聚乙二醇辛基苯基醚，150 mmol/L氯化鈉，0.1%十二烷基磺酸鈉，調節pH至7.4]低溫裂解15 min。收集裂解產物，4 ℃，12 000×g離心30 min，用BCA試劑盒測定收集到的上清液的總蛋白濃度。在收集到的總蛋白中加入等體積蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮10 min。取30 μg總蛋白上樣進行電泳，于10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠分離目的蛋白。將帶有目的蛋白的凝膠置于轉膜儀上，轉膜儀恒壓15 V轉膜30 min，使蛋白印跡至硝酸纖維素膜，隨后放入5%脫脂奶粉中，搖床以20 r/min的速度晃動并孵育抗體室溫封閉2 h。相應的3種一抗分別于4 ℃孵育過夜，次日TBST(TBS+吐溫)[成分包括20 mmol/L 3-羥甲基-氨基甲烷-鹽酸，0.1% tween-20(吐溫-20)，500 mmol/L氯化鈉]洗滌硝酸纖維素膜5次，每次5 min，隨后加入辣根過氧化物酶標記的二抗在37 ℃下孵育 2 h，TBST洗滌5次，每次5 min。最后用化學發光法進行顯色。所有Western boltting檢測均重復3次。

1.2.4qPCR檢測 分別收集HL-7702、MHCC97H、MHCC97L的HCC細胞并用預冷的磷酸鹽緩沖溶液洗滌一次，參照RNA提取試劑盒說明書分別提取3種細胞總RNA。以總RNA為模板，參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。再以cDNA為模板，借助不同的基因引物序列，使用ABI7500 qPCR儀檢測相關基因的表達。GADPH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的上游引物： 5′-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3′，下游引物：5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3′(擴增長度198 bp)；GPC3的上游引物：5′-GTTGTGAAAGGTGCTTATCT-3′，下游引物：5′-GAAGGGT-TTGAAAGTGGA-3′(擴增長度192 bp)；4E-BP1上游引物： 5′-CTATGACCGGAAATTCCTGATGG-3′，下游引物：5′-CCCGCTTATCTTCTGGGCTA-3′(擴增長度160 bp)；PS6K的上游引物：5′-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3′，下游引物：5′-ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC-3′(擴增長度445 bp)。反應程序為95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，共35個循環。以GADPH的表達作為內參，采用2-ΔΔCt法分析3種基因的mRNA表達水平。所有qPCR檢測均重復3次。

2 結 果

2.1GPC3、4E-BP1和PS6K在HCC中的表達及其與預后的關系 利用在線網站cbioportal分析結果顯示，GPC3、4E-BP1、PS6K表達異常的HCC患者生存時間明顯短于表達正常的HCC患者(P=0.028 1，P<0.001，P=0.011 9)，整體生存率和生存周期均降低，見圖1a-c。GEPIA網站分析顯示，PS6K低表達(n=182)的HCC患者總體生存率顯著高于PS6K高表達(n=182)的患者(P=0.097)，見圖1d。

GPC3：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；4E-BP1：真核細胞啟動因子4E結合蛋白1；PS6K：核糖體S6蛋白激酶；HCC：肝細胞癌；cases with Alteration(s) in Query Gene(s)：基因突變者；cases without Alteration(s) in Query Gene(s):無基因突變者；1a:GCP3的表達變化與生存時間的相關性；1b：4E-BP1的表達變化與生存時間的相關性；1c：PS6K的表達變化與生存時間的相關性；1d：PS6K表達高低與生存時間的相關性

圖1 GCP3、4E-BP1和PS6K mRNA表達變化與HCC預后的關系

2.2MHCC-97H、HL-7702、MHCC-97L細胞中GPC3、4E-BP1和PS6K mRNA的表達水平 qPCR結果顯示，與HL-7702細胞系相比，MHCC-97H細胞表達的GPC3和PS6K mRNA水平顯著升高(t=8.734，P<0.001；t=4.977，P<0.001)，4E-BP1 mRNA水平降低(t=8.426，P<0.001)，而MHCC-97L細胞GPC3 mRNA表達水平降低(t=6.457，P<0.001)，4E-BP1 mRNA水平升高(t=5.572，P<0.001)，PS6K mRNA水平差異無統計學意義(t=1.875，P=0.067)。與MHCC-97L細胞系相比，MHCC-97H細胞表達的GPC3和PS6K mRNA水平顯著升高(t=32.465，P<0.001；t=5.413，P<0.001)，4E-BP1 mRNA水平降低(t=29.669，P<0.001)。見表1。

2.3MHCC-97H、HL-7702、MHCC-97L細胞中GPC3、4E-BP1和PS6K蛋白的表達水平 Western blot結果顯示，與HL-7702細胞系相比，MHCC-97H細胞表達的GPC3和PS6K蛋白水平顯著升高(t=5.538，P<0.001；t=8.279，P<0.001)，4E-BP1蛋白水平降低(t=6.475，P<0.001)，而MHCC-97L細胞表達的GPC3和PS6K蛋白水平顯著降低(t=8.407，P<0.001；t=8.716，P<0.001)，4E-BP1蛋白水平升高(t=10.363，P<0.001)。與MHCC-97L細胞系相比，MHCC-97H細胞表達的GPC3和PS6K蛋白水平顯著升高(t=8.725，P<0.001；t=7.914，P<0.001)，4E-BP1蛋白水平降低(t=28.466，P<0.001)。見表2、圖2。

HCC細胞系GPC34E-BP1PS6KMHCC-97L2.34±0.429.13±0.125.23±0.25HL-77024.35±0.155.71±0.185.57±0.19MHCC-97H8.12±0.211.28±0.458.19±0.54

HCC：肝細胞癌；GPC3：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；4E-BP1：真核細胞啟動因子4E結合蛋白1；PS6K：核糖體S6蛋白激酶

HCC細胞系GPC34E-BP1PS6KMHCC-97L0.34±0.041.13±0.030.31±0.02HL-77020.55±0.050.47±0.040.48±0.01MHCC-97H0.82±0.010.18±0.070.82±0.07

HCC：肝細胞癌；GPC3：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；4E-BP1：真核細胞啟動因子4E結合蛋白1；PS6K：核糖體S6蛋白激酶

HCC：肝細胞癌；GPC3：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；4E-BP1：真核細胞啟動因子4E結合蛋白1；PS6K：核糖體S6蛋白激酶

圖2不同侵襲能力的HCC細胞系中GPC3、4E-BP1和PS6K蛋白表達情況

2.4GPC3、4E-BP1和PS6K的在不同侵襲能力的HCC細胞系表達的相關性 經R語言編程進行相關性矩陣分析，結果顯示，在MHCC-97L中，GPC3與4E-BP1呈負相關(r=-0.850)，GPC3與PS6K呈正相關(r=0.868)，PS6K與4E-BP1呈負相關(r=-0.898)；在MHCC-97H中，GPC3與4E-BP1呈負相關(r=-0.877)，GPC3與PS6K呈正相關(r=0.888)，PS6K與4E-BP1呈負相關(r=-0.898)。見圖3。

GPC3：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；4E-BP1：真核細胞啟動因子4E結合蛋白1；PS6K：核糖體S6蛋白激酶；HCC：肝細胞癌；A:MHCC-97L；B:HL-7702；C:MHCC-97H；a：GPC3；b：PS6K；c:4E-BP1

圖3 GPC3、4E-BP1和PS6K在3種HCC中的相關性分析

3 討 論

目前肝癌的發病率及惡性程度越來越高，能否早期診斷并預測其惡性及轉移程度成為亟待解決的問題。目前，眾多研究者正在嘗試利用多種方法預測肝癌的轉移及惡性程度，如通過分析患者常規肝功能和腫瘤標志物結果等[3-4]。本研究試圖尋找與HCC侵襲能力直接相關的基因并探討其作為預測惡性程度標志物的可能性。

GPC3是一種分泌性的細胞外糖蛋白，依靠磷脂酰肌醇錨定在細胞膜上，通過結合細胞外基質或蛋白酶等影響下游信號傳遞，調控細胞生長和分化。GPC3是肝癌診斷的重要標志物，其在肝癌組織中的表達與肝癌患者的預后密切相關[5]。mTOR信號通路調控細胞的生長和增殖，該通路的異常激活與多種惡性腫瘤發生、發展有關。mTOR通路激活后分別調控兩種下游信號：4E-BP1和PS6K，這兩者與mTOR直接結合發揮作用。4E-BP1通過結合真核起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)抑制蛋白表達。4E-BP1經mTOR磷酸化后失去與eIF4E結合的能力，進而促進與細胞生長相關的蛋白質的翻譯。另一方面，mTOR激活PS6K后，PS6K可磷酸化核糖體S6蛋白，從而增加含嘧啶序列mRNA的翻譯，這些mRNA表達的蛋白通常是核糖體蛋白和翻譯調節蛋白。因此，mTOR下游底物PS6K和4E-BP1分別對細胞的生長起正、負調節作用。多腫瘤的形成伴有mTOR信號通路的異常調控，如腫瘤細胞增殖、周期的調控、細胞遷移侵襲等[6-10]。

GPC3在肝細胞肝癌中表達異常，并且在腫瘤細胞增殖、分化、侵襲和轉移過程中發揮重要調節作用[11]，可作為特異性的腫瘤標志物診斷HCC[12]。此外，有文獻報道，肝癌組織GPC3的異常表達與腫瘤分級、臨床病理分期密切相關，可用于預測腫瘤復發或轉移及患者的生存期[13]。PS6K可影響整個細胞周期的過程，尤其是G1期向S期的轉化，還可以抑制凋亡分子 Bcl-2的活性從而減少細胞凋亡，此外還能誘導腫瘤細胞對缺氧環境的耐受，分泌缺氧誘導因子-1α增加血管內皮生長因子的表達[14]。有文獻報道，PS6K基因功能的異?；蜻^表達可增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，并與細胞骨架肌動蛋白的重組、上皮-間充質轉化等相關[15]。4E-BP1是一種小分子蛋白質，通過與eIF4E結合抑制mRNA的翻譯，磷酸化的4E-BP1將失去與eIF4E結合的能力，上調mRNA的翻譯。4E-BP1在腫瘤中的作用較復雜，有研究證實在多種腫瘤中，腫瘤細胞可通過高表達eIF4E避開4E-BP1介導的負調控[16]。eIF4E是真核細胞翻譯起始和調控的核心成分，與mRNA 5′端帽子結構結合后調控蛋白質翻譯起始過程[17-18]。

本研究使用在線網站cbioportal分析結果顯示，GPC3、4E-BP1、PS6K表達異常的HCC患者與表達正常HCC患者的預后差異有統計學意義，整體生存率和生存周期均降低。因此，生物信息學數據為探討GPC3、PS6K、4E-BP1在HCC中的表達及其與預后之間的關系奠定了良好的理論基礎。本研究結果顯示，與MHCC-97L和HL-7702細胞相比，高侵襲力的MHCC-97H細胞的GPC3、PS6K的mRNA和蛋白水平均顯著升高，而4E-BP1的mRNA和蛋白水平從高到低則依次為HL-7702、MHCC-97L、MHCC-97H，且各種細胞株之間差異均有統計學意義。有文獻報道，GPC3與生長因子相互作用，可作為激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/mTOR信號通路的上游信號分子，而mTOR下游底物PS6K和4E-BP1分別促進和抑制細胞的增殖及生長[19]。本研究通過R語言進行蛋白表達的相關性分析顯示，高侵襲能力的HCC細胞系GCP3和PS6K表達增高，4E-BP1表達降低，并呈顯著相關性，而在侵襲能力最弱的MHCC-97L細胞中情況相反，這些結論為診斷和檢測HCC的發生提供了一定的理論基礎。此外，有研究證明血清中GPC3水平的檢測可作為HCC的潛在檢測指標。有研究使用酶聯免疫吸附測定法測量HCC患者的血清GPC3水平，結果顯示，在HCC患者中報告的陽性率為36.1%～95%[20-22]。

綜上所述，GPC3在mTOR通路中發揮重要作用，激活mTOR后上調PS6K的表達，同時抑制4E-BP1表達，這3種基因與腫瘤細胞的侵襲能力相關。因此，檢測GPC3、PS6K、4E-BP1蛋白的表達情況，可為預測肝癌患者術后腫瘤轉移，預后及選取治療方案提供理論基礎，在HCC發生、發展中也具有重要價值。