MTHFR基因C677T及A1298C多態性與自然流產的關系

黃中秀，李小蘭，李小松

(重慶市黔江中心醫院檢驗科，重慶 409000)

自然流產指妊娠28周內非人為因素導致的流產，胎兒體重低于1 000 g，其發生機制尚不明確，主要與遺傳、內分泌異常、感染等因素有關，臨床上約50%的自然流產原因難以明確[1-3]。葉酸為核酸合成、細胞生長、胚胎發育的重要物質，不僅能預防新生兒出生缺陷(如唇腭裂)，還可減少自然流產的發生[4]。有學者指出，孕早期血清葉酸水平可能影響妊娠結局[5]。葉酸代謝障礙可能增加心臟畸形、肢體畸形等出生缺陷以及妊娠期高血壓等并發癥的發生率[6]。目前尚無葉酸代謝障礙的標準定義，臨床常通過基因多態性檢測進行判斷。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因是葉酸代謝相關基因之一，研究發現，MTHFR基因C677T位點突變是自然流產發生的危險因素[7-8]。由此可見，體內葉酸水平可能與自然流產有關。本研究通過檢測自然流產患者體內葉酸、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平以及MTHFR基因C677T、A1298C多態性，探討葉酸相關MTHFR基因C677T、A1298C多態性與自然流產的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年10月至2017年6月在重慶市黔江中心醫院婦產科就診的150例自然流產患者作為觀察組，選擇同期230名門診常規孕檢正常妊娠女性作為對照組。觀察組納入標準：①妊娠28周內非人為因素導致的妊娠終止，胎兒體重1 000 g以內；②年齡18～40歲；③內分泌功能和生殖器結構正常者；④初中及以上文化程度。所有受試者臨床資料完整，均排除器質性病變、生殖道感染、夫妻雙方染色體異常、既往自然流產史等因素，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集 收集受試者相關臨床資料，包括年齡、孕周、分娩史、體質指數(body mass index，BMI)、葉酸使用情況等。

1.2.2血清葉酸、Hcy水平檢測 采集受試者清晨空腹外周靜脈血2 mL，離心機分離后將血清保存于-20 ℃冰箱內待測。采用直接化學發光法通過化學發光免疫分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，UniCel DxI 800)檢測血清葉酸水平，采用循環酶法全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，BS-350)檢測血清Hcy水平。

1.2.3MTHFR基因C677T、A1298C多態性檢測 采集外周靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管，采用柱式DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司，批號：69504)對樣本DNA進行提取，使用Taqman-MGB探針(美國ABI公司)檢測MTHFR基因C677T、A1298C位點，C677T、A1298C引物序列分別為GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG、CTCCCGCAGACCTTCTCCTTCAA、AAGAACGAAGACTTCAAAGACTT、CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA。反應體積10 μL(2X MasterMix、去離子水、DNA模板、20X引物分別為5 μL、3.5 μL、1 μL、0.5 μL)。反應條件：95 ℃預變性10 min后，于92 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s進行20個循環擴增，再行89 ℃ 15 s，60 ℃ 90 s 30個循環擴增。完成后使用熒光定量聚合酶鏈反應儀(美國應用生物系統公司，ABI 7900型)讀取終點熒光，MTHFR C677T包括CC、CT、TT三個基因型。

2 結 果

2.1兩組臨床資料比較 觀察組與對照組年齡、孕周、分娩史、BMI比較差異均無統計學意義(P>0.05)；觀察組圍孕期葉酸使用率低于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組臨床資料比較

BMI：體質指數；對照組：正常妊娠者；觀察組：自然流產者；a為t值，余為χ2值

2.2兩組血清葉酸、Hcy水平比較 觀察組血清葉酸水平低于對照組，血清Hcy水平明顯高于對照組(P<0.01)，見表2。

組別例數葉酸(μg/L)Hcy(μmol/L)對照組23010.92±4.159.37±2.95觀察組1508.76±2.1211.68±3.06t值5.8917.352P值<0.001<0.001

Hcy：同型半胱氨酸；對照組：正常妊娠者；觀察組：自然流產者

2.3兩組MTHFR基因C677T多態性比較 兩組MTHFR基因C677T位點基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(χ2=0.001，P>0.05)，提示樣本具有群體代表性。觀察組MTHFR基因C677T的TT基因型、T等位基因頻率高于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組MTHFR基因C677T基因型、等位基因頻率比較 [例(%)]

MTHFR：亞甲基四氫葉酸還原酶；對照組：正常妊娠者；觀察組：自然流產者

2.4兩組MTHFR基因A1298C多態性比較 兩組MTHFR基因C677T位點的基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(χ2=1.056，P>0.05)，提示樣本具有群體代表性。觀察組與對照組MTHFR基因A1298C基因型、等位基因頻率比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 兩組MTHFR基因A1298C基因型、等位基因頻率比較 [例(%)]

MTHFR：亞甲基四氫葉酸還原酶；對照組：正常妊娠者；觀察組：自然流產者

3 討 論

自然流產對女性生理及心理健康均可造成不同程度的影響，還關系到其家庭和諧。近年來，由于工作環境(如美容美發行業接觸染發劑、燙發劑等化學試劑)、生育史(既往流產、多次妊娠)、生育政策(二胎政策)、生育年齡偏高等因素的影響，自然流產的發生率有升高趨勢，因此受到廣泛關注。趙雪芬和王靜[9]通過Logistic多因素回歸分析發現，自然流產的獨立危險因素包括高齡、孕期陰道出血、孕期感染、有不良妊娠史等，而孕期葉酸補充是自然流產的保護因子。朱燁[10]研究發現，孕前BMI偏低、文化程度較低、既往流產史是發生不明原因自然流產的危險因素，而圍孕期口服葉酸、血清高葉酸水平是其保護因素。由此可見，血清低葉酸水平可能增加自然流產的發生風險。研究發現，復發性流產患者血清葉酸水平偏低，口服葉酸后其葉酸代謝異常明顯好轉，早期復發流產的發生率降低，改善了患者的妊娠結局[11]。

葉酸為人體必需的營養物質之一，具有不耐熱、分子量低的特點[12-13]。綠色蔬菜、水果等食物中葉酸的含量較多，但食物加工過程可導致葉酸的破壞。此外，代謝產物、腸道環境等因素也可不同程度地影響葉酸的吸收，故食物中葉酸的生物利用度較低。妊娠期女性對葉酸的需求較未妊娠時升高2～4倍，因此孕期葉酸的補充十分必要[14-15]。我國女性備孕前3個月、孕早期3個月需補充葉酸400 μg，但受個體體質的影響，臨床上孕婦葉酸缺乏仍較常見[16]。Hcy為蛋氨酸、半胱氨酸代謝的中間產物，被認為是一種神經毒性物質，血清高Hcy水平易致畸，還可導致胎兒凝血/抗凝系統異常和胎盤栓塞，最終引起胎兒死亡[17-18]。何可人等[19]研究顯示，自然流產患者血清葉酸水平較正常妊娠女性顯著降低，而血清Hcy水平顯著較高，提示低葉酸水平、高Hcy水平可能是妊娠期發生自然流產的危險因素，本研究與其研究結果一致，故建議妊娠女性圍孕期適當補充葉酸，以預防自然流產的發生。

葉酸在人體DNA的合成及甲基化中發揮重要作用，妊娠女性葉酸代謝障礙可能導致自然流產、唐氏綜合征等相關疾病的發生[20]。葉酸代謝障礙可能與葉酸代謝相關酶基因多態性異常變化有關[21-23]。MTHFR是葉酸代謝過程的關鍵酶之一，定位于1p36.32，由656個氨基酸組成，可將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸，5-甲基四氫葉酸可為細胞內基因甲基化提供原料，是細胞內基因甲基化開始的重要標志，在甲硫氨酸合成酶作用下，5-甲基四氫葉酸與維生素B12結合，促使血漿Hcy的再甲基化。

C677T、A1298C是臨床較常見的MTHFR基因位點，其中C677T位點突變即核苷酸上胞嘧啶C突變成胸腺嘧啶T，纈氨酸序列上丙氨酸轉變成纈氨酸，導致基因型表達蛋白酶活性下降，耐熱性降低，進而促使血清葉酸水平下降以及Hcy水平升高，并對血管內皮細胞造成不同程度的損害，促使血小板聚集，從而引發胎盤病變，最終導致流產[24-26]。臨床上，常通過檢測MTHFR C677T基因型判斷機體葉酸代謝障礙情況，其中CC型表示蛋白酶活性高，葉酸轉化能力正常，高Hcy血癥發生風險低等；CT型表示蛋白酶活性及葉酸轉化活動能力中等，高Hcy血癥發生風險中等；TT型表示蛋白酶活性低，葉酸轉化能力低下，高Hcy血癥發生風險較高。本研究結果顯示，觀察組MTHFR C677T的TT基因型、T等位基因的頻率均較對照組顯著升高，提示MTHFR C677T基因位點突變可能參與自然流產發生，C677T可使雜合子基因型、純合子基因型內一種熱不穩定蛋白酶的活性分別下降35%、70%，易導致Hcy水平升高，進而損害血管內皮細胞，引起血小板聚集，導致流產風險增加。A1298C分布在MTHFR基因第7外顯子，其突變會導致MTHFR還原酶活性下降，但其對自然流產的影響較MTHFR C677T基因位點突變小。郁長治等[25]研究發現，新疆維爾族女性自然流產與MTHFRC677T、MTRRA66G有關，而與A1298C基因位點突變無關，本研究結果與上述研究相符。關于MTHFRC其他基因型以及其他基因對自然流產的影響仍需進一步深入研究。

影響自然流產的因素較多，如年齡、既往自然流產史等，本研究排除既往自然流產史病例，同時選取年齡、孕周、BMI、分娩史相匹配的正常妊娠女性作為對照，避免了上述因素對研究結果的影響。但葉酸代謝障礙相關基因多態性存在地區分布的特點，關于不同地區葉酸代謝障礙相關基因多態性對自然流產的影響尚有待進一步多中心、大樣本的研究。

綜上所述，自然流產患者血清葉酸水平較低，Hcy水平較高，MTHFR C677T可能與自然流產相關，而A1298C與自然流產無關。圍孕期女性應常規補充葉酸，以減少自然流產的發生，提高妊娠成功率；妊娠早期需檢測血清葉酸、Hcy水平，并根據檢測結果合理補充葉酸。