Ⅰ型子宮內膜樣癌中ABCA1、ApoA1及SR-B1的表達及意義

王 玥，鄭秀妍，江 滕，王 超，牛 肖，鄒 泓

子宮內膜癌(endometrial carcinoma, EC)是發生于子宮內膜的惡性腫瘤，位居女性生殖系統惡性腫瘤的第2位[1]。EC分為Ⅰ型(雌激素依賴型)和Ⅱ型(非雌激素依賴性)，其中Ⅰ型EC又稱子宮內膜樣癌(endometrioid adenocarcinoma, EA)，占所有EC的80%～85%。近年多數文獻報道膽固醇脂質代謝與腫瘤的發生、發展密切相關，是子宮內膜癌、腎癌、結腸癌等[2]多種腫瘤的致病因素。本課題組前期實驗結果顯示，在膽固醇代謝分子中，B類1型清道夫受體(scavenger receptor class B type 1, SR-B1)可促進細胞對HDL膽固醇酯的選擇性吸收；ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)和載脂蛋白A1(apolipoprotein A1, ApoA1)可將膽固醇酯從細胞內轉運至細胞外，三者共同在細胞吸收與轉運膽固醇酯中發揮重要作用。在Ⅰ型EC組織中SR-B1比對照增生改變子宮內膜組織高表達，同時雌激素受體(estrogen receptor, ER)和孕激素受體(progesterone receptor, PR)低表達[3]。本實驗采用免疫組化EnVision兩步法檢測ABCA1和ApoA1的表達差異；分析Ⅰ型EC中ABCA1、ApoA1與SR-B1、ER、PR蛋白表達的相關性及與臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2011年1月～2016年12月石河子大學醫學院第一附屬醫院病理科存檔的Ⅰ型EC 80例，并選取診斷為增生改變子宮內膜組織47例作為正常對照組。Ⅰ型EC中ABCA1掉片8例，ApoA1掉片11例；增生改變子宮內膜組織中ABCA1掉片3例，ApoA1掉片4例。由兩名資深病理醫師閱片后制備芯片，根據2014年國際婦產科聯盟(FIGO)制定的手術-病理分期對全部腫瘤進行分級分期[11]。

1.2 方法免疫組化染色采用EnVision兩步法。一抗為ABCA1(Ab18180，稀釋比1 ∶100)和ApoA1(Ab52945，稀釋比1 ∶4 800)，均購自美國Abcam公司；免疫組化EnVision染色試劑盒、二抗及DAB顯色試劑，均購自北京中杉金橋公司；PBS緩沖液購自上海生物工程公司。用PBS無菌液代替一抗作為空白對照。

1.3 結果判斷ABCA1和ApoA1均為胞質/胞膜著色，根據陽性細胞數及著色強度分別計分。根據陽性細胞著色強度計分：無著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕褐色為3分；按陽性細胞數所占百分比計分：陽性細胞數≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。ABCA1和ApoA1總分為陽性細胞百分比及著色強度相乘分級，所得分數<3分為(0)；3～5分為(+)；6～9分(2+)及>9分為(3+)。最終得分：(0)為陰性，(1+)為弱陽性，(2+～3+)為強陽性。

1.4 統計學分析所有數據均采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。對ABCA1和ApoA1的表達采用陽性率(%)進行描述，組間陽性率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，等級資料相關性分析采用Spearman等級相關分析。以P<0.05(雙側)為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ⅰ型EC與對照增生改變子宮內膜組織中ABCA1和ApoA1的表達免疫組化結果顯示，ABCA1在Ⅰ型EC中的陽性率(86.1%，62/72)低于對照增生改變子宮內膜組織(95.5%，42/44)，差異有統計學意義(χ2=16.583，P=0.001)；ApoA1在Ⅰ型EC中的陽性率高于(63.8%，44/69)對照增生改變子宮內膜組織(53.3%，23/43)，差異無統計學意義(χ2=1.661，P=0.646,表1)。將ABCA1和ApoA1在Ⅰ型EC和增生改變子宮內膜的表達按照陰性(0)和弱陽性(1+)和中等陽性和強陽性(2+～3+)分組，結果顯示ABCA1在Ⅰ型EC中陽性率(34.7%，25/72)低于增生改變子宮內膜組織(72.7%，32/44)，差異有顯著性(χ2=15.782，P<0.001)；而ApoA1在Ⅰ型EC組織和增生改變子宮內膜組織中表達差異無顯著性(χ2=0.966，P=0.326，表2，圖1～4)。

表1 Ⅰ型子宮內膜樣癌和對照增生改變子宮內膜組織中ABCA1和ApoA1的表達

圖1 Ⅰ型EC組織中ABCA1蛋白的表達，EnVision兩步法 圖2 增生改變子宮內膜組織中ABCA1蛋白的表達，EnVision兩步法 圖3 Ⅰ型EC組織中ApoA1蛋白的表達，EnVision兩步法 圖4 增生改變子宮內膜組織中ApoA1蛋白表達，EnVision兩步法

2.2 Ⅰ型EC中ABCA1和ApoA1與SR-B1、ER、PR表達的相關性Ⅰ型EC中ABCA1與ApoA1、SR-B1、ER、PR蛋白表達進行Spearman等級相關分析，結果顯示：在Ⅰ型EC組織中ABCA1與SR-B1、ApoA1、ER蛋白表達均呈負相關(r=-0.219，P=0.008；r=-0.259，P=0.002；r=-0.224，P=0.007)，ApoA1與PR蛋白表達呈正相關(r=0.219，P=0.009)，差異均有統計學意義(P<0.05)；其他未見明顯相關性。

2.3 Ⅰ型EC中ABCA1和ApoA1的表達與臨床病理特征的相關性統計分析結果顯示，ABCA1和ApoA1蛋白表達與Ⅰ型EC臨床病理特征未見明顯相關性(表3)。

表2 Ⅰ型子宮內膜樣癌和對照增生改變子宮內膜組織中ABCA1和ApoA1的陽性率[n(%)]

表3 Ⅰ型子宮內膜樣癌中ABCA1和ApoA1表達與臨床病理特征的相關性

*ABCA1蛋白組，有1例失訪

3 討論

近年文獻研究顯示，肥胖與Ⅰ型EC的關系密切，是與子宮內膜癌發病相關的危險因素[4]。脂質代謝是否參與Ⅰ型EC的發生、發展，值得進一步深入探索。HDL做為唯一將細胞外膽固醇逆向轉運至細胞的脂蛋白，其相關分子的功能失衡可能參與腫瘤細胞的發生、發展。HDL代謝的核心蛋白包括轉運蛋白ABCA1、ApoA1以及吸收蛋白SR-B1。ABCA1最早于1999年由Bodzioch等[5]報道，屬于ABC轉運家族，定位于9q31，突變易導致丹尼爾病(tangier disease, TD)。ABCA1可通過水解三磷酸腺苷轉運多種底物，介導細胞內游離(未酯化)膽固醇和磷脂向細胞外的ApoA1蛋白轉運，在膽固醇逆向轉運中起關鍵性作用[6]。此外，ABCA1還參與離子、糖、類固醇激素、膽汁酸、氨基酸、肽和維生素等多種物質的跨膜轉運。文獻報道顯示，ABCA1的甲基化和表達異?？赡軈⑴c前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、神經膠質母細胞瘤等多種腫瘤的發生、發展[7-10]。ApoA1是高密度脂蛋白膽固醇的主要結構蛋白，目前研究結果顯示，ApoA1除了在炎癥及腫瘤的生物學行為[11]中發揮重要作用外，測量惡性腫瘤患者血清中ApoA1等脂蛋白的含量可評估患者的預后[12-13]。此外，血清中ApoA1可能作為胃癌診斷的潛在血清生物學標志物[14]。SR-B1又稱HDL受體，可促進細胞對HDL膽固醇酯的選擇性吸收。SR-B1過表達可能參與前列腺癌、腎癌及乳腺癌的發生、發展[15]。正常細胞的膽固醇穩態是細胞表面受體通過內流和外排聯合調節，HDL受體SR-B1可介導膽固醇酯轉入到細胞內，而ABCA1可將細胞內多余的膽固醇酯轉出細胞外，與細胞外的ApoA1結合后進一步修飾形成成熟的HDL，從而維持細胞的膽固醇穩態。

本實驗結果顯示，在Ⅰ型EC中ABCA1表達低于正常子宮內膜，可能存在膽固醇酯轉運功能的下降。作者的前期實驗已驗證SR-B1比對照增生改變子宮內膜相對高表達，使得細胞內HDL膽固醇酯吸收增多，提示在Ⅰ型EC中ABCA1的低表達和SR-B1的高表達可能參與其脂質代謝的失衡。ApoA1比對照增生改變子宮內膜相對高表達，但差異無統計學意義。以上提示在Ⅰ型EC的膽固醇酯轉運分子中，ABCA1起主導作用，ApoA1協同轉運，需在細胞功能學方面進一步驗證。

ABCA1、ApoA1和SR-B1、ER、PR表達的相關性分析結果顯示，在Ⅰ型EC組織中，ABCA1與SR-B1、ApoA1蛋白的表達均呈負相關，提示Ⅰ型EC中可能存在HDL吸收蛋白與轉運蛋白的表達失衡。課題組前期結果顯示，ER和PR低表達，與趙時梅等[16]報道的結果一致；此外SR-B1的表達與ER、PR呈正相關，提示若SR-B1的表達能夠誘導低分化EC恢復ER、PR的表達，可能提高EC對激素化療藥物治療的敏感性[3]。本組實驗中，ABCA1與ER蛋白表達呈負相關，提示HDL轉運蛋白ABCA1與ER的表達異常，可能共同參與Ⅰ型EC的發生、發展。

清華大學顏寧教授等研究團隊首次獲得重組ABCA1近原子級分辨率的結構，提出ABCA1是以lateral access的方式轉運細胞內膽固醇[17]。ABCA1是細胞內膽固醇酯外流的關鍵轉運體，在抗動脈粥樣硬化治療中已經取得認可和應用。此外，Bloise等[18]發現許多腫瘤的耐藥是由于ABCA1編碼的多藥耐藥基因(MDR)高表達引起的，在成人白血病治療中，由于MDR1高度表達導致治療失敗。有研究發現在結直腸癌晚期患者中ABCA1明顯過表達，其促進腫瘤的增殖，促進上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，使腫瘤侵襲力增加，導致結直腸癌預后較差[19]。

SR-B1可選擇性介導HDL膽固醇酯轉運到細胞和組織，還可以促進脂溶性維生素的吸收，促進病毒進入宿主細胞。已有研究顯示，在胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌和卵巢癌等大多數腫瘤樣本中，SR-B1表達顯著增加[20]，在食管鱗狀細胞癌、鼻咽癌組織中SR-B1均過表達。因此，SR-B1可作為癌癥診斷和預后的潛在標志物。SR-B1可能成為納米HDL遞送治療藥物的良好靶向通道，并能提高靶向化療藥物療效。因此，在SR-B1陽性的Ⅰ型EC中，是否可以應用HDL納米粒子通過SR-B1通道遞送激素類治療藥物(甲地孕酮等)治療，提高癌細胞對藥物的精準攝取，減少藥物的毒副作用，值得進一步分析。

綜上所述，本實驗首次在Ⅰ型EC中報道了與膽固醇代謝相關的分子ABCA1、ApoA1的表達以及與ER、PR、SR-B1表達的相關性，結果提示在Ⅰ型EC中可能存在HDL膽固醇酯吸收分子SR-B1與轉運分子ABCA1的表達失衡；此外，ABCA1與ER間的相關性提示，Ⅰ型EC不僅存在脂質代謝的異常，也存在性激素受體的缺失，是否在Ⅰ型EC的發生、發展中起到重要作用，值得深入分析。