MARCH2在胃癌中的異常表達及臨床意義

夏 丹

胃癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其在東亞國家尤其是在中國發病率最高。胃癌是國內第三大腫瘤相關性死亡的主要原因[1]。MARCH2(membrane associated RING-CH protein 2)是MARCH家族的成員之一，含RING結構域，作為E3泛素連接酶，可調節細胞運輸、DNA修復和信號轉導等多種細胞活動。近年有文獻報道MARCH2與病毒免疫逃逸蛋白密切相關，HIV-1感染時MARCH2表達水平升高[2]。MARCH2的泛素化底物包括Dsh[3]、CFTR[4]、β2AR[5]和DLG1[6]，其在腫瘤中的作用鮮有報道。本文應用免疫組化SP法檢測MARCH2在125例胃癌組織中的表達，并探討MARCH2表達與胃癌臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2000年1月～2016年12月山東醫學高等?？茖W校附屬醫院和北京大學第三醫院存檔的原發性胃癌手術切除標本125例及正常胃黏膜組織標本30例。其中男性96例，女性29例，中位年齡60歲(33～82歲)，所有患者術前均未行化療、放療及生物治療。病理診斷及組織學分級均由兩名病理醫師確診。所選病例臨床資料完整，其中高分化腺癌1例，中分化腺癌28例，低分化腺癌96例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期26例，Ⅲ期76例，Ⅳ期12例；85例有淋巴結轉移。標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片6張備用。收集患者的臨床病理資料，包括患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期(UICC/AJCC 2010)。

1.2 試劑兔抗人MARCH2多克隆抗體(美國Abcam公司)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋公司)、SP免疫組化超敏染色試劑盒(福州邁新公司)。

1.3 方法采用免疫組化SP法染色，抗原修復為高壓熱修復，修復液使用1 mmol/L EDTA(pH 9.0)，一抗為MARCH2(1 ∶100)，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，DAB顯色。用已知MARCH2陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定由兩位病理醫師獨立閱片綜合判斷。每張切片隨機觀察5個有代表意義的高倍視野，每個高倍視野計數150～200個細胞，蛋白表達采用免疫反應評分(immunoreactivity score, IRS)，將著色細胞數比例與著色強度相結合。按著色細胞占計數細胞百分率計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。按著色強度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕色為3分。將兩項得分結果相乘：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽性(+)；5～8分為中等陽性()；9～12分為強陽性()。如果兩名病理醫師評分差異>3分，則該標本需重新評分。

1.5 統計學分析采用SPSS 15.0軟件進行統計學分析，組間比較采用χ2檢驗，兩變量之間的相關性采用Spearman等級相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MARCH2在胃癌組織中的表達MARCH2染色主要位于腫瘤細胞胞質和(或)胞核，呈彌漫棕色顆粒狀(圖1)。125例胃癌組織中MARCH2陰性34例，弱陽性21例，中度陽性53例，強陽性17例。MARCH2在胃癌組織中的陽性率為72.8%(91/125)。30例正常胃黏膜組織中MARCH2陰性23例，弱陽性7例。MARCH2在正常胃黏膜組織中的陽性率為23.3%(7/30)。MARCH2在胃癌組織中的陽性率明顯高于正常胃黏膜組織，差異有統計學意義(P<0.01，表1)。

2.2 MARCH2表達與胃癌臨床病理特征的關系MARCH2表達與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期密切相關(P<0.01，表2)。MARCH2表達與患者年齡、性別和腫瘤直徑無關。

圖1 MARCH2在胃癌組織中的表達，SP法：A.MARCH2陰性；B.MARCH2弱陽性；C.MARCH2中度陽性；D.MARCH2強陽性

表1 胃癌及正常胃黏膜組織中MARCH2的表達

表2 MARCH2表達與胃癌臨床病理特征的相關性

3 討論

MARCH家族是一個結構上相關聯的蛋白家族，其成員結構特點為由N端的RING-CH結構域和緊連的C端兩個或多個跨膜區組成，這種跨膜RING-CH finger蛋白具有多種生物學功能，如免疫調節、蛋白質控和膜運輸[7]。

目前MARCH家族有11個成員(MARCH-I-XI)[8]。MARCH-Ⅱ基因是Bartee課題組在2004年發現，定位于第19號染色體短臂13區2帶(19p13.2)，基因全長25 746 bp，其開放讀碼框編碼246個氨基酸，相對分子質量為2.6×104。TMHMM軟件分析和功能結構域分析顯示MARCH-Ⅱ是二次跨膜蛋白，由N端RING domain、中間的二次跨膜區和C端的PDZ domain構成。功能研究顯示，MARCH-Ⅱ能降解細胞表面受體如轉鐵蛋白受體(TfR)和共刺激分子B7.2(CD86)[7]。應用免疫熒光觀察到MARCH蛋白與內質網以及溶酶體共定位[7]。Xavier研究團隊在HEK293T細胞中證實MARCH-Ⅱ也能定位在細胞膜上，通過其PDZ motif與DLG1相互作用促進DLG1泛素化，減弱DLG1在細胞連接點的表達，影響細胞的極性[9]。Shenoy課題組證實MARCH-Ⅱ能與β2AR相互作用，β2AR拮抗劑卡維地洛能夠增強MARCH-Ⅱ與β2AR相互作用促進β2AR的內吞和溶酶體降解。MARCH-Ⅱ也能促進β2AR的泛素化，調節細胞表面的β2AR水平[5]。最近Guggino科研團隊研究發現，在囊性纖維化支氣管上皮細胞中MARCH-Ⅱ通過與CAL(CFTR相關的配體)和STX6結合泛素化并降解CFTR[4]。CFTR是質膜cAMP調節的Cl-通道，負責經上皮的鹽和液體的運輸。CFTR基因功能缺失性突變會引起致死性退行性基因遺傳病囊性纖維化(cystic fibrosis, CF)[10]。已有研究顯示，CFTR缺陷會引起自噬的減低，導致蛋白聚集體的積累、肺部炎癥和CF的發生。累積的數據顯示，CFTR在腫瘤的進展和轉移中發揮重要作用。根據腫瘤類型不同，CFTR遺傳變異可能增高或降低腫瘤發生的風險[11-13]。目前研究尚不能確定在腫瘤細胞中CFTR和自噬之間的關系，且CFTR與MARCH2在自噬中的功能關系尚不清楚。

本組先前實驗證實了MARCH2負向調控細胞自噬[14]；MARCH2過表達會損傷自噬，表現為過表達MARCH2導致LC3B-Ⅱ水平的減少和內外源性自噬性底物降解的減弱，該效應的發揮一方面牽涉PIK3CA/AKT-MTOR信號通路的活化，另一方面可能是通過與CFTR相互作用，促進其功能失活而實現的[14]。然而，MARCH2在腫瘤中的作用并不清楚。

本實驗在前期研究基礎上應用免疫組化法檢測了自噬負向調節因子MARCH2在125例胃癌中的表達并且評估了MARCH2表達與臨床病理特征的關系。本實驗發現，MARCH2在胃癌中的表達水平明顯高于正常胃黏膜組織，提示MARCH2可能參與癌癥的發生。本實驗結果亦顯示，MARCH2陽性染色更多出現在浸潤深度更深、有淋巴結轉移或更高TNM分期的胃癌組織中，提示MARCH2可能在腫瘤進展中發揮作用。這些結果提示MARCH2參與了胃癌的發生、發展，MARCH2可能成為胃癌診斷、治療和評估預后的分子靶標。