神仙豆中脂肽產生菌的篩選及脂肽特性分析

陳志娜，薛詠振，葉韜,2，劉天，沈業橋

1(淮南師范學院 生物工程學院， 安徽 淮南， 232038)2(資源與環境生物技術安徽普通高校重點實驗室，安徽 淮南， 232038)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為革蘭氏陽性桿狀細菌，好氧，分布廣泛[1]，在其生長代謝的過程中能夠分泌多種抗菌物質，包括核糖體合成的抗菌蛋白和抗菌肽，如細菌素，和非核糖體合成的脂肽類化合物[2-3]，主要有Iturin、Fengycin和Surfactin三大類[4-5]。脂肽類化合物是由疏水脂肪酸尾部和親水寡肽結構構成的雙親分子[6]。與細菌素相比，脂肽具有耐熱性和抗蛋白酶水解等優點，此外，脂肽還具有廣譜抗菌、抗支原體、抗腫瘤、抗病毒等生物活性[7]。表面活性素(Surfactin)是由C12～C17的β-脂肪酸鏈和7個氨基酸構成的環狀脂肽，作為一種生物表面活性劑，與化學表面活性劑相比具有毒性低和生物降解性高等特點，并且可以在極端的溫度、pH和鹽度下保持表面活性[8]。Surfactin是目前已知最有效的生物表面活性劑之一，能顯著降低水的表面張力，可有效抑制真菌、細菌等的生長，且乳化和氣泡特性顯著，在食品加工保藏、飼料養殖、化妝品、生物醫藥、石油工業等領域具有較高的應用價值，越來越受到人們的關注[9]。

神仙豆是皖北地區民間發酵豆制品，是大豆經浸泡、煮熟、密封后自然發酵而成，其發酵菌種主要為芽孢桿菌屬[10]。本研究以從神仙豆中篩選出的芽孢桿菌為研究對象，采用血平板法、排油法、抑菌實驗及特定基因檢測等方法，對產脂肽類物質的菌株進行篩選與鑒定，并對其所產脂肽的特性及結構進行分析，為該菌株在食品加工及保藏中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

待測菌株，分離自皖北特色神仙豆；黑曲霉Aspergillusniger，淮南師范學院食品質量與安全實驗室保藏；細菌基因組DNA抽提試劑盒、16S rDNA細菌鑒定試劑盒、PCR反應相關試劑，上海生工；成品血瓊脂培養基，國藥集團化學試劑有限公司；Surfactin標準品，Sigma公司；乙腈、三氟乙酸、甲醇(均為色譜級)，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺，蘇州博萊爾凈化設備有限公司；EX Zone2電子天平，深圳安普特電子科技有限公司；BSC-250恒溫恒濕培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠； ABI 型PCR儀，美國ABI公司；GEL DOC XR凝膠成像系統，美國Bio-rad；5804R型離心機，Eppendorf公司；HPLC2998高效液相色譜，Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株篩選與鑒定

1.3.1.1 血平板初篩

在無菌條件下，將活化后的菌株轉接到血瓊脂平板培養基上，于37 ℃下培養48 h后觀察菌落周圍有無溶血現象并記錄。

1.3.1.2 發酵上清液制備

將活化后的菌株轉接到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于37 ℃、140 r/min 的搖床中培養48 h，10 000 r/min離心10 min后，發酵上清液過0.45 μm孔徑水系濾膜除菌，進行性質測定。

1.3.1.3 排油活性檢測

取60 mL無菌水加入到直徑為90 mm玻璃皿中，在水面上加入5 mL液體石蠟，形成油膜后加入0.2 mL無菌發酵上清液，形成排油圈，測量直徑，每個處理重復3次。

1.3.1.4 抑黑曲霉活性測定

黑曲霉于28 ℃恒溫培養箱中培養5 d后，吸取10 mL生理鹽水加入到培養基中，用接種環刮取孢子溶解到生理鹽水中，混勻后，采用血細胞計數法進行計數[11]，配制孢子濃度為104～105CFU/mL的孢子懸液，振蕩均勻。取100 μL孢子懸液均勻涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)中，用無菌鑷子將無菌牛津杯置于培養基中心，吸取150 μL發酵上清液注入牛津杯中，于28 ℃恒溫培養箱中培養2 d后，觀察抑菌效果[12]。

1.3.1.5 脂肽合成相關基因檢測

將待測菌株接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于37 ℃、170 r/min搖床中培養24 h，10 000 r/min離心收集沉淀，按照細菌基因組DNA抽提試劑盒提取待測菌株的總DNA。擴增引物序列參考文獻[13]，引物sfp(編碼Surfactin合成中的4′-phosphopantetheiny transferase，675 bp)：sfpF (5′-ATGAAGTTTACGGAAT-TTA-3′)，sfpR (5′-TTATAAAAGCTCTTCGTACG-3′)；引物ituD(編碼ituD synthetase D， 1203 bp)：ituDF (5′-ATGAACAATCTTGCCTTTTTA-3′)，ituDR (5′-TTATTTTAAAATCCGCAATT-3′)；lpa-14 (編碼脂肽抗菌素iturin A，675 bp)：lpa-14F (5′-GAAAATTTACGGAGTATATATGGACCGC-3′)，lpa-14R (5′-TT-ATAACAGCTCTTCATACGTTTTCATCTC-3′)。PCR采用25 μL體系，以待測菌株基因組DNA為模板，反應條件：擴增sfp為94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，48 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30個循環；72 ℃、10 min；檢測ituD和lpa-14為94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，58 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，30個循環；72 ℃、10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢驗，拍照分析。

1.3.1.6 菌株鑒定

以待測菌株的總DNA為模板進行PCR擴增，采用正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR采用25 μL體系，反應條件為： 94 ℃、5 min； 94 ℃、30 s，55 ℃、30 s； 72 ℃、1.5 min，共30個循環； 72 ℃、5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢驗后送通用生物系統(安徽)有限公司進行測序。所得序列通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行序列相關性分析，采用MEGA 4.0軟件、以Neighbor-joining法構建系統發育樹。

1.3.2 脂肽粗提物定性分析

1.3.2.1 Surfactin的制備及傅里葉變換紅外光譜分析

將菌株BS6-2接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37℃、170 r/min搖床培養2 d，取一定量發酵液10 000r/min離心20 min去除菌體。參考NAIR等[14]的方法，發酵上清液經酸沉、酸洗、堿中和后用冷凍干燥得Surfactin提取物。利用溴化鉀壓片法對Surfactin提取物進行紅外光譜掃描，確定樣品中的主要官能團。

1.3.2.2 高效液相色譜定性分析

參考朱震等[15]的條件，略有修改。高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)分析系統Waters Breeze HPLC，色譜柱為Waters RP-C18Analytical Column(5 μm，4.6 nm×250 nm)；檢測波長為210 nm，柱溫30 ℃；采用等梯度洗脫進行樣品分析，所用流動相A為乙腈，流動相B為水(含0.1%三氟乙酸)，流動相比例V(A)∶V(B)=70∶30，流速1.0 mL/min,進樣量10 μL。

1.3.2.3 超高效液相色譜-電噴霧四級桿-飛行時間質譜(ultra-performance liquid chromatography-electron spray ionization-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UPLC-ESI/Q-TOF MS)分析

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測模式；離子源溫度為20 ℃；毛細管電壓3 000 V；錐孔電壓30 V；去溶劑氣體流速500 L/h；去溶劑溫度500 ℃；錐孔氣流50 L/h；范圍m/z100～1 500，檢測時間10 min。

1.3.3 Surfactin粗品乳化特性分析

1.3.3.1 乳化指數(E24測定)

(1)

式中：h1為乳化層高度；h2為液體總高度。

1.3.3.2 乳化穩定性測定

參考朱震等[15]的方法，將振蕩混勻后的乳化液靜置96 h，每間隔24 h測量乳化指數，按公式(2)計算乳化穩定性：

(2)

式中：E0為靜置0 h時溶液的乳化指數，Et為溶液靜置th時的乳化指數。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選

從神仙豆中共分離出25株菌株，經血瓊脂平板初篩，篩選出5株溶血效果明顯的菌株BS6、BS6-2、BS17和BS18和BS19。5株菌株的排油圈直徑、抑黑曲霉效果如表1所示，菌株合成Surfactin和Iturin A的相關基因檢測結果如圖1所示。由表1可知，菌株BS6和BS6-2的排油圈直徑最大；BS6-2、BS17和BS18的發酵上清液對黑曲霉的抑制效果最好，說明5株菌均能產生脂肽。由圖1可知，菌株BS6、BS6-2中擴增出sfp基因，菌株BS17、BS18、BS19中擴增出sfp和lpa-14基因，5株菌中均沒擴增到ituD基因。說明菌株BS6、BS6-2所產脂肽可能為Surfactin，菌株BS17、BS18、BS19所產脂肽可能為Surfactin和Iturin A。進一步對5株菌所產脂肽(1 mg/mL)對黑曲霉的抑制活性進行測定(表1)，結果表明，5種脂肽均有抑菌效果，其中菌株BS6-2所產脂肽對黑曲霉的抑制效果最強。綜上，BS6-2的排油圈直徑和抑菌效果均最佳，因此，挑選該菌株進行后續實驗。

表1 菌株的排油能力和對黑曲霉的抑制效果比較Table 1 Comparison of oil-spread capability and anti-Aspergillus niger activity among screened bacterial strains

M-DL 2000 Marker；1、4、7、10、13-菌株BS6、BS6-2、BS17、BS18、BS19的sfp基因；2、5、8、11、14-菌株BS6、BS6-2、BS17、BS18、BS19的ituD基因；3、6、9、12、15-菌株BS6、BS6-2、BS17、BS18、BS19的lpa-14基因圖1 脂肽相關基因(sfp、ituD、lpa-14)擴增電泳圖譜Fig.1 Specific amplified results of lipopeptide related genes(sfp, ituD, lpa-14)

2.2 菌株BS6-2的鑒定

經PCR擴增和序列測定，獲得菌株BS6-2的16S rDNA序列片段。進一步經過BLAST在線比對，該序列與B.subtilisstrain subtilis (MN611449.1)、B.subtilis(AJ276351.1)、B.subtilisstrain 50-1 (MH475924.1)、B.subtilisstrain SR2-27 (MN421466.1)的相似性達到99%，與相近種構建系統發育樹，如圖2所示，初步確定菌株BS6-2為枯草芽孢桿菌B.subtilis。Bacillus屬可產生多種抗菌物質和蛋白酶、淀粉酶等酶類，在工業生產中具有重要作用。LEE等[9]從韓國傳統發酵豆制品chungkookjang中分離篩選出1株脂肽產生菌Bacillussp. LM7，經鑒定LM7所產脂肽共包含8種物質，分別為4種芽孢菌霉素D和4種Surfactin 同系物；ZHANG等[17]從番茄根際篩選出1株具有抑真菌活性的菌株B.amyloliquefaciensW10，其抑菌活性物質為Iturin A(C14～C16)、Fengycin A(C14～C15)、Fengycin A(C16～C17)和Surfactin(C13～C16)；NAIR等[14]發現海洋綠藻內生菌Bacillussp.可分泌兩大類環狀脂肽Surfactin和Fengycin；JEONG等[18]發現B.siamensis可以產生抗菌物質，其基因序列顯示至少存在4個與抗菌物質相關的基因簇，如Iturin、Fengycin、Bacillaene和Difficidin。菌種鑒定的結果表明，菌株BS6-2可能是一種潛在的生物活性物質產生菌。

圖2 菌株BS6-2的16S rDNA系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain BS6-2 based on the 16S rDNA sequence

2.3 Surfactin提取物的定性分析

圖3為菌株BS6-2所產Surfactin的紅外圖譜，由圖3可知，3 299.74 cm-1處的寬展吸收峰是由OH和NH基團伸縮振動引起的[19]。2 960～2 860 cm-1和1 455～1 380 cm-12處窄尖吸收是脂肪酸鏈的C—H伸縮振動[20]。1 653.47 cm-1和1 547.74 cm-12處窄尖強吸收為酰胺鍵，說明樣品中含有肽鏈[15]。綜上說明該樣品為脂肽類物質。

圖3 菌株BS6-2所產脂肽物質的傅里葉變換紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of crude lipopeptide from strain BS6-2

對提取的脂肽樣品經 CH3OH 萃取后采用乙腈和三氟乙酸的水溶液作為流動相進行高效液相色譜分析，與Surfactin標準品進行比對，結果如圖4所示。由圖4-a可知，Surfactin標準品在保留時間4.00～6.00 min出現4個特征峰。不同色譜條件Surfactin標準品的保留時間會出現差異。LEE等[9]以0.1%的甲酸和含0.1%甲酸的乙腈進行梯度洗脫，Surfactin標準品的保留時間集中在12.00～12.73 min。由圖4-b可知，樣品在保留時間4.00～6.00 min出現3個特征峰，且3個峰均位于標準峰附近，因此可以推測樣品為Surfactin的同系物。

a-Surfactin標準品；b-Surfactin提取物圖4 樣品的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC fingerprints of samples

Surfactin的典型結構為不同長度的β-羥基脂肪酸鏈(一般為C12～C15)和L-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-D- Leu6-L- Leu7，通過內置鍵鏈接而成的環狀結構[21]。另外，Surfactin的同系物還包括一些氨基酸殘基的取代物，比如(Val7)Surfactin、(Ile7)Surfactin、(Ala4)Surfactin和(Asp1，Glu5)Surfactin[22]，這些氨基酸殘基的取代會極大地影響Surfactin的生物活性[23]。研究報道B.coagulans可以產生2種Surfactin同系物，第7位氨基酸分別為Leu和Val[23]；BAUMGART等[24]也鑒定出兩種Surfactin同系物，第7位氨基酸上的Leu分別被Val和Ile取代。圖5為Surfactin標準品(a)和Surfactin提取物(b)的[M+H]+質譜圖，由圖5可知，2個樣品均出現了1 008、1 022、1 036m/z3個 [M+H]+離子峰，之間相隔分子量為14，即CH2—，分子量與Surfactin同系物一致，可判斷分別代表C13～C15Surfactin同系物。根據分子量可初步推斷菌株BS6-2產Surfactin的3種同系物為β-OH-C13-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu(Ile)，第7位氨基酸殘基具體是哪一個還有待進一步分析。

a-Surfactin標準品; b-Surfactin提取物圖5 樣品的質譜圖Fig.5 Mass spectrum of samples

2.4 Surfactin提取物的乳化特性分析

微生物表面活性劑是由疏水性和親水性兩個部分組成的兩親性代謝物，可以在不同極性的液相之間的界面上進行分配。脂肽是一種很典型低分子量微生物表面活性劑，可以有效地降低表面張力和界面張力。有大量的研究表明表面活性與乳化活性之間有直接正相關性[16]，因此E24經常被用來作為一種有效的篩選方法。圖6為菌株BS6-2所產將Surfactin提取物的乳化指數E24(以吐溫-80作對照)。結果表明，Surfactin提取物和吐溫-80的乳化指數E24均隨著溶液濃度增大而升高，且兩者乳化指數E24差別不大。當Surfactin提取物溶液濃度高于500 mg/L時，E24達到55%以上，略低于芽孢桿菌ZG0427所產表面活性劑的E24，當其質量濃度為500 mg/L時，E24可達到61.5%[25]，一般認為若E24>50%就表明具有很強的乳化能力[26]。圖7為不同質量濃度的Surfactin提取物溶液的乳化穩定性隨時間的變化規律。由圖7可知，不同質量濃度的Surfactin提取物質量溶液在放置的過程中其乳化穩定性均有所下降，特別是在前24 h，穩定性下降幅度比較大，后趨于平穩；Surfactin提取物濃度越高，乳化穩定性越強，當濃度>500 mg/L時，放置96 h后，乳化穩定性下降25%左右，穩定性較好。由此可見，Surfactin提取物溶液具有較好的乳化活性。

圖6 不同質量濃度Surfactin提取物溶液的乳化指數Fig.6 Emulsification index of Surfactin extract at different concentrations

圖7 不同質量濃度Surfactin提取物的乳化穩定性Fig.7 Emulsification stability of Surfactin extract at different concentrations

3 結論

本研究通過溶血性、排油圈、抑菌試驗及其編碼基因檢測，篩選出1株產Surfactin的菌株BS6-2。經16S rDNA分子生物學鑒定，將菌株BS6-2鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis。利用傅里葉變換紅外光譜、高效液相色譜和UPLC-ESI/Q-TOF MS分析，推測菌株BS6-2所產Surfactin為3種同系物，其可能結構為β-OH-C13-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu(Ile)。Surfactin提取物表現出良好的乳化性能和抑黑曲霉活性，但其有效組分仍需進一步分離純化。