神經遞質的可視化熒光檢測技術研究進展

胡巧，史雨馨，楊曉玲，張靜，李波，廖曉玲，劉雪

1 重慶科技學院 納微復合材料與器件重慶市重點實驗室，重慶 401331

2 重慶科技學院 納微生物醫學檢測技術重慶市工程實驗室，重慶 401331

神經遞質主要是指在神經化學傳遞中完成信號轉導的特定化學物質，促使肌體完成特定的生物學反應[1]。測定腦神經遞質的濃度變化和空間分布，是探索人類感知和思維的基礎，同時也是預防和診斷治療腦神經疾病的基礎。但是由于人體是一個復雜的環境，內源性成分干擾大[2]，體內神經遞質含量少，往往在特定的神經環路中處于不斷的更新變化和代謝的動態平衡中，且疾病的發生往往是多種神經遞質含量變化的共同結果[3]。因而，對神經遞質的高時間和空間分辨率的可視化檢測一直是生物醫學分析的難點。

近年來光致發光的熒光蛋白和通過低分子物質催化而發光的發光蛋白被廣泛地應用于生物小分子的檢測中[4]，基于熒光和發光蛋白發展起來的檢測方法相較于傳統的方法具有較高的時間和空間分辨率，有效解決了傳統分析方法不能實時檢測活細胞中神經遞質分布規律或不能反映神經遞質活性變化的弊端。開發針對神經遞質的生物探針一直是國際神經科學上的重大課題，旨在復雜的生物體系中實現高時間和空間分辨率的檢測快速變化的特定神經遞質。這要求神經遞質探針設計時，選擇恰當的受體蛋白和熒光蛋白，構建具有高特異性、能精確反映神經遞質真實動態信息的生物傳感器。本文綜述近年來利用熒光和發光蛋白開發的可視化監測技術和在不同神經遞質中的應用情況，包括了具有較好研究基礎的谷氨酸 (Glutamic acid， Glu)和 γ-氨 基 丁 酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，以及近幾年新發展的多巴胺 (Dopamine，DA) 和乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh) 探針，歸納總結了不同方法的優缺點，并對未來神經遞質探針發展進行了展望，為神經遞質的可視化監測提供較為系統的參考。

1 神經遞質的熒光可視化方法

目前神經遞質的體內檢測技術主要分為3類。第一類經典檢測技術是微透析，但是由于其采樣量大、采樣率低和時間分辨率低，使其不適用于復雜和快速演變的行為中檢測神經遞質的動態變化[5]。第二類技術是快速掃描循環伏安法(Fast scan cyclic voltammetry，FSCV)，FSCV 具有出色的時間分辨率 (亞秒級)、高靈敏度 (納摩爾級) 和空間分辨率 (微米級)。然而，FSCV 難以區分結構相似的神經遞質，例如DA和去甲腎上腺素 (Norepinephrine，NE)[6]。此外，微透析和FSCV都需要將相對較大的探針 (直徑約為70–300 mm) 植入腦組織，這限制了對內源性神經遞質釋放空間的精確測量[7]。第三類是隨著熒光蛋白和發光蛋白發展起來的各類神經遞質生物傳感器。這類生物傳感器具有更加優良的時間和空間分辨率，可以實現對細胞內不同區域中的神經遞質快速釋放過程的可視化監測，如細胞器(0–10 μm)、脂筏 (70 μm 左右) 等，是現階段最具研究價值的神經遞質監測方法。目前，第三類檢測方法主要包含兩種較為成熟的技術：基于熒光共振能量轉移 (Fluorescence resonance energy transfer，FRET) 技術的生物傳感器和基于單熒光蛋白的生物傳感器。

1.1 基于FRET的生物傳感器

近年來熒光技術發展迅速，基于FRET技術的神經遞質傳感器發展日趨成熟，因其可以實現活體、原位條件下信號分子的動態實時檢測而被廣泛應用于生命科學研究中，通過蛋白構象改變(結合/解離) 誘導兩個熒光基團產生熒光共振現象，不僅可以檢測神經遞質活性，還可以實現神經遞質在突觸間隙/細胞內的動態空間分布的可視化[8]。FRET生物傳感器的設計需要考慮兩個主要問題，首先是選擇恰當的感知結構域，能對目標神經遞質產生特異性的生物反應，發生構象的變化；其次是兩個熒光基團FRET效率的變化必須足夠大，確保熒光強度比 Ia/Id的變化足夠明顯，便于相關成像設備檢測。與傳統的技術相比，基于FRET的神經遞質傳感器能夠在不損傷活細胞的前提下研究神經遞質在不同腦功能區的時空分布，可以高特異性地實現在視網膜切片、突觸間隙和活體等多個模型的長期穩定成像，具有更加優良的時間和空間分辨率。

1.2 基于單熒光蛋白的生物傳感器

單熒光探針也是實現可視化監測神經遞質的理想工具。比如，構象敏感的綠色熒光蛋白的突變體 (Circularly permutated green fluorescent protein，cpGFP)，它是由GFP序列前后置換改造而來，其熒光強度可由多肽鏈N端和C端不同的結合狀態而改變。探針蛋白與目標神經遞質結合后，由于構象改變而引發cpGFP熒光強度的變化。與FRET探針相比，cpGFP探針的結構更加簡單，單熒光記錄模式適用范圍更廣，特別適合于組織切片以及在體內可視化檢測神經遞質釋放的時空規律。通過病毒轉染實現體內表達，記錄不同腦功能區中單個細胞的活動，甚至可以分辨單個樹突棘中的神經活動。cpGFP作為熒光輸出模塊，具有熒光強度高、表達效率高和熒光穩定好的優勢，是構建結構更簡單的神經遞質傳感器的理想工具。典型代表包括了檢測Glu的iGluSnFR[9]、檢測 GABA的 iGABASnFR[10]、檢測 DA的GRABDA[11]和 dLight1[12]，以及檢測 ACh的GACh[13]。

2 可視化方法在不同神經遞質中的應用

2.1 谷氨酸

谷氨酸是脊椎動物中樞神經系統中主要的興奮性氨基酸神經遞質[14]，介導著復雜的信號傳遞，基本上影響所有形式的行為，精神分裂癥和帕金森等神經類疾病的發生都是由于谷氨酸濃度和分布的變化而引發的[15]。經過多年研究，谷氨酸探針已經成為發展最為成熟且種類最多的神經遞質可視化監測技術。

Okumoto等[16]通過將綠色熒光蛋白變體 FP附著到成熟天冬氨酸結合蛋白ybeJ (也稱為GltI)的每個末端構建了初代谷氨酸納米傳感器FLIPE。谷氨酸結合會觸發 GltI內的構象變化，從而使得cpGFP的去質子化和熒光增強。FLIPE能夠靶向定位于亞細胞區室，可用于監測活細胞表面的寬濃度范圍內的谷氨酸濃度變化，適用于測量膠質谷氨酸代謝和轉運、可視化溢出效應和生物體中神經元活性等。在視網膜中，谷氨酸含量和分布的變化是導致糖尿病引起的視網膜神經退行性病變[17]、急性青光眼節細胞死亡等重要原因[18]。為了揭示谷氨酸在視網膜中釋放的時空變化規律與信息傳遞的關系，Firl等[19]創建了基于FRET的優化谷氨酸傳感器 FLII81E-1μ。表達該探針蛋白并孵育視網膜切片，記錄到了突觸間隙中類似于鈣波的谷氨酸波，揭示了通過內網狀層傳播的谷氨酸釋放的時空變化規律與信息傳遞的關系。

iGluSnFR[9]系列的生物傳感器也是實現可視化檢測谷氨酸的一種重要的技術 (圖 1)，iGluSnFR是一種由大腸桿菌GltI和cpGFP構建的單波長Glu傳感器，突破性地實現了在完整組織中可視化谷氨酸釋放過程。iGluSnFR具有適合于體內成像的信噪比和動力學，可對原位谷氨酸特異性反應。應用iGluSnFR在樹突棘上觀察到了大而快速的Glu信號，測量了視網膜中雙極細胞的感受野，有效地實現了在體細胞、樹突、視網膜、蠕蟲、斑馬魚和老鼠中長期穩定的成像。iGluSnFR具有高谷氨酸親和力和大的動態范圍，但目前的時間分辨率不適用于監測突觸中谷氨酸快速釋放。因此，Helassa等[20]通過對連接子和結合親和力優化，開發了兩個可快速檢測的iGluSnFR 變體 iGluf (用于“快速”) 和 iGluu (用于“超快速”)，實現了在高頻傳輸過程中準確跟蹤突觸中谷氨酸動態，并精確調控同谷氨酸結合過程中產生熒光的明亮程度。與iGluSnFR相比，iGluf和iGluu在體外的構象變化速度提升6倍，在突觸中的動力學速度提高了5倍，并且能夠直接報告100 Hz的離散突觸谷氨酸釋放事件。最近報道的紅色熒光的R-iGluSnFR1進一步擴展了谷氨酸傳感器的顏色[21]。

Masharina團隊[22]基于 FRET技術研發的半合成熒光傳感器蛋白 (Snifits) 在神經遞質的檢測中也占據著重要的地位。Snifits是由SNAP-tag[23]、CLIP-tag[24]和分析物結合蛋白組成的融合蛋白 (圖 2)。Snifit利用天然受體-拮抗劑對，為細胞表面熒光代謝物傳感器的設計提供了思路。例如，基于離子型谷氨酸受體5 (iGluR5) 設計的針對Glu的傳感器Snifit-iGluR5。Snifit-iGluR5能在HEK 293細胞表面顯示對Glu最大的熒光比率變化為 1.56，高于任何其他現有的谷氨酸生物傳感器。此外，Snifit-iGluR5在細胞表面上用遠紅色熒光基團進行的專有標記將有助于在組織樣品上或體內應用以及與其他生物傳感器組合使用，進一步優化和表征將允許原位檢測Glu的生理水平。

圖1 iGluSnFR結構示意圖[9]Fig. 1 iGluSnFR structure diagram[9].

圖2 Snifit-iGluR5結構示意圖[22]Fig. 2 Snifit-iGluR5 structure diagram[22].

2.2 γ-氨基丁酸

GABA是抑制性神經遞質，調控多種神經疾病，如癲癇[25]、焦慮癥和精神分裂癥[26]。GABA功能的詳細表征需要以高時間和空間分辨率測量其濃度。目前GABA探針已有一定基礎，但結構較復雜，應用仍不夠廣泛。

基于FRET的熒光生物傳感器非常適合測量體內的小分子濃度。Masharina等[27]利用Snifit構建了第一個用于測量活細胞表面GABA濃度的熒光比率傳感器GABA-Snifit (圖3)，可以在活哺乳動物細胞的表面上以高特異性和時空分辨率檢測GABA。當在細胞表面組裝時，GABA-Snifit允許感測微摩爾至毫摩爾GABA濃度。此外，可以使用GABA-Snifit來定量GABAB受體激動劑、拮抗劑和變構調節劑的作用的相對結合親和力。GABA-Snifit是研究GABA和GABAB受體在生物系統中功能的有價值的工具。然而，它在神經元系統中的效用是有限的，添加兩個單獨的小分子使傳感器的結構復雜化，并且其對GABA的親和力非常弱 (約400 μmol/L)。此外，GABA受體的過表達可能破壞細胞信號傳導，GABA受體的異源寡聚化可能降低傳感器功能。

圖3 GABA-Snifit結構示意圖[27]Fig. 3 GABA-Snifit structure diagram[27].

Marvin等[10]基于谷氨酸受體 iGluSnFR的原理，開發出可檢測 GABA濃度的熒光探針iGABASnFR。實現了對培養神經元和急性小鼠腦切片中GABA釋放效用的觀測。應用iGABASnFR追蹤了線粒體中GABA含量，在體內觀察到小鼠視皮層中的大量GABA瞬變，并利用癲癇模型進一步檢測iGABASnFR的可行性。最后，在斑馬魚中，利用iGABASnFR將小腦中的GABA能信號與運動輸出相關聯。iGABASnFR具有現有GABA傳感器中最佳的性能，是唯一適合體內使用的GABA傳感器。未來的iGABASnFR將向著可控的親和力、動力學和更優的信噪比發展。

針對以上GABA探針結構較復雜且需一定時間等待基因表達的問題。Hu等[28]在GABAB受體的胞外區兩端連接熒光蛋白，構建了基于 FRET的GABA探針FGB1-VFT。在體外表達該探針蛋白并孵育腦片，可實現對神經組織中突觸釋放的快速檢測。

2.3 多巴胺

DA是非常重要的單胺類神經遞質，參與調節廣泛的復雜過程，包括獎勵信號[29]、感知學習、注意力的變化和運動控制[30]。在人腦中，DA的傳播和受損同多種神經類疾病有著緊密的聯系，如精神分裂癥[31]和帕金森[32]。

CNiFERs[33]可以測量通過 G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs) 發出信號的任何神經遞質的釋放，且具有天然GPCR的特性，保留了內源表達受體的化學特異性、親和力和時間動力學。迄今為止，利用CNiFERs已經實現了對體內 ACh、DA和 NE的檢測。Muller等[34]創建的檢測DA的CNiFERs (圖4)，它具有納摩爾的高靈敏度、秒的時間分辨率以及較寬的動態范圍，并且對大腦的影響較小。目前，已有報道利用 CNiFERs傳感器研究學習期間腦內神經遞質DA釋放過程的動力學，并將CNiFERs移植到小鼠額葉皮層內，得到小鼠學習與獎勵時，神經信號的變化。CNiFERs傳感器為研究DA在神經系統中更復雜的行為提供了更高的時間和空間分辨率。

圖4 CNiFERs結構示意圖[33]Fig. 4 CNiFERs structure diagram[33].

dLight1[12]在急性腦切片和行為期間小鼠中能進行動態的高分辨率成像，亞微摩爾親和力和快速動力學造就了高時間分辨率，能夠長期跟蹤監測由學習引起的紋狀體中DA毫秒級的變化情況。

GRABDA[11]將cpGFP作為熒光輸出模塊偶聯到神經遞質受體上，構建受體-cpGFP嵌合體，隨后通過突變、篩選和表征得到性能優異的神經遞質傳感器 (圖 5)。GRABDA能夠在離體和體內的多個模型系統中，對內源性DA動態進行特異性的實時檢測。與現有的檢測方法相比，GRABDA具有更高的靈敏度，較大的表觀親和力，優異的膜運輸性；相對較小的基因編碼區，可適用于轉基因和病毒包裝；對DA具有高度特異性；具有快速響應動力學，適合快速檢測神經遞質的釋放情況。

2.4 乙酰膽堿

ACh介導中樞和外周神經系統以及非神經系統的細胞間通訊。ACh釋放含量和分布同注意力、感知力、聯想學習和睡眠/清醒平衡[35]都有密切關系。CNiFERs傳感器也可以實現對 ACh的檢測[33]，CNiFER直接植入大腦，能夠以小于100 μm的空間分辨率感知神經遞質ACh釋放。

Jing[13]通過將cpGFP耦合到毒蕈堿型ACh受體 (Muscarinic receptor，MR) 中構建一種更加用戶友好、廣泛適用的GACh傳感器 (圖6)。利用病毒或者遺傳學手段轉染ACh給十幾種不同動物來源的神經元及非神經元細胞，從而驗證了GACh傳感器的性能。GACh傳感器具有高靈敏度、信噪比、對細胞生理學干擾小和強的光穩定性，適用于監測體外、離體和體內不同組織中的膽堿能信號。

圖5 GRABDA結構示意圖[11]Fig. 5 GRABDA structure diagram[11].

圖6 GACh結構示意圖[13]Fig. 6 GACh structure diagram[13].

3 總結與展望

神經遞質釋放是神經網絡中信息處理的核心部分，在神經科學的研究中神經遞質濃度的時間和空間變化可視化是完全理解神經網絡工作原理的必要部分。神經遞質的可視化檢測一直是科學研究中的一大難題，主要是由于：第一，在神經系統中存在化學或結構同神經遞質類似的物質，這會對檢測的特異性、準確性造成干擾；第二，神經遞質在人體中濃度較小且處于不更新變化和代謝的動態平衡中，想要實時觀察神經遞質的釋放過程就要求檢測工具具有足夠高的時間和空間分辨率，較強的熒光比率；第三，如果是針對某一特定區域監測神經遞質濃度的變化情況，還要求監測工具具有一定的靶向性，以特異性分析特定位置神經遞質的濃度變化情況；第四，對神經遞質的研究一般是針對單細胞/突觸水平以及神經元或體內小網絡中神經遞質釋放規律，這就要求監測工具的結構/體積盡量不要太復雜/大。

要實現神經遞質的可視化，還需在以下幾個方面進行努力。首先，選擇恰當的感應模塊和熒光報告模塊成為提高神經遞質傳感器特異性和簡化傳感器結構/體積的關鍵；其次，提高傳感器的分辨率和動態響應范圍，一方面可以通過改造發色團偶極取向，另一方面可以通過突變發色團附近的氨基酸殘基，篩選特異性更好、靈敏度更高和動態響應范圍更大的發色基團[36]；最后，利用遺傳編碼等技術持續開發更多的檢測工具，尋找更優的熒光和發光蛋白都將為神經遞質的可視化帶來突破性進展。

在過去二十年里，各類熒光探針的開發所取得的成果為未來實現神經遞質的可視化監測奠定了堅實的基礎。其中DA和ACh兩種神經遞質的受體為單亞基結構，近年來基于 cpGFP的熒光探針發展逐漸成熟，使二者的探針可以用于體外、體內等不同組織[11,13,37]。而 Glu和 GABA的探針雖然發展時間較長且種類較多，但由于其受體的雙亞基結構，所開發出的探針往往結構復雜，以體外應用為主。作為神經系統中最主要的兩類神經遞質Glu和GABA的檢測仍需要更有效的探針。神經遞質可視化生物傳感器各具特色，在不同的性能指標上具有一定的差異 (表1)，合理的選擇和優化檢測工具將推進神經遞質傳感器解決更多的現實問題。除以上神經遞質外，其他神經遞質的可視化工具也值得進一步研究，現有的神經遞質探針多以受體為目標進行改造，限制了探針的空間移動性。Ca2+探針是神經影像學中廣泛使用的工具，借鑒 Ca2+探針的理念，熒光探針進入細胞膜內，和細胞內的酶發生反應，生成裝載細胞內的生物探針。這類神經遞質探針不受細胞膜的空間限制，將突破性地提高神經遞質探針的應用范圍。

另一方面，對神經遞質可視化檢測技術的研究可以以需求為導向，利用神經系統中的經典模型或者久未解決的問題推動研究工作的開展。比如在視網膜的外網狀層中，GABA是否參與了負反饋調節一直是爭論的焦點[38]。當免疫熒光、電生理等傳統技術都無法解決這一問題時，尋找合適的GABA釋放實時可視化監測技術可能是解決問題的關鍵。

除了為不同的神經遞質開發新的可視化監測技術外，生物發光技術的不斷進步也引發了用于腦成像的生物發光傳感器的革命。相關研究通過將現有的基于FRET的生物傳感器中的供體與熒光素酶交換，開發了新的基于生物發光共振能量轉移技術 (Bioluminescent resonance energy transfer，BRET) 的生物傳感器。特別是用NanoLuc替代FRET傳感器中的CFP使得BRET傳感器具有良好的靈敏度和響應幅度。由于大多數基于FRET的生物傳感器是模塊化的，因此該方法原則上可適用于開發各種生物分子或功能的BRET生物傳感器。目前，已經開發了針對ATP[39]、膜電壓[40]和Zn2+[41]的BRET傳感器。未來將基于BRET的生物傳感器引入對神經遞質的可視化監測是必然的趨勢。此外，可以將螢光素酶 (例如NanoLuc和teLuc) 直接插入適當的感知結構域中，以得到高熒光強度的生物傳感器。

表1 可視化神經遞質傳感器性能指標列表Table 1 A list of neurotransmitter sensor performance indicators

各類熒光探針的發展還同相關的光學儀器和成像數據處理技術有著緊密的聯系，近年來多光子成像[42]、數字光片顯微鏡[43]、像差校正多焦點顯微鏡[44]和空間光調制器顯微鏡[45]的發展將為各類熒光探針的發展提供保障?？偟膩碚f，神經遞質的可視化研究已經具備較好的基礎，未來的神經遞質檢測技術必然向著無創、定量特異、信號增強和實時可視化發展，具有更高時間和空間分辨率的神經遞質檢測工具在神經生物學中將有十分良好的應用前景。