橙色熒光蛋白的研究進展及其應用

彭穩，何培民，施定基,2，賈睿

1 上海海洋大學 海洋生態與環境學院，上海 201306

2 中國科學院植物研究所，北京 100093

細胞生物學的研究需要對活細胞內的各種代謝過程和細胞通路進行詳細、準確的描述。各種熒光染料由于其毒性所以不能在活體細胞中很好地使用，而熒光蛋白 (Fluorescent protein，FPs) 可以在光譜成像中顯示出明亮的熒光[1]，在活細胞、深層組織和全身的成像容易[2]，也就成為更好的替代品。隨著熒光顯微技術的進步，FPs可作為探針以跟蹤細胞內分子間相互作用，追蹤特定代謝產物的代謝途徑，也可以結合到傳感器中將細胞活動轉化為生物信號[3-4]。

1962年，下村修等在維多利亞管狀水母Aequorea victoria體內首次分離得到綠色FPs[5]。此后綠色FPs在生物學領域得到了廣泛運用，但是其發射光譜僅僅局限于440–529 nm，細胞內成像背景較高，且不能解決皮下深層組織的成像問題[6]。1999年，Matz等從印度洋-太平洋地區的珊瑚蟲 (Discosomasp.) 中分離并改進得到紅色FPs——DsRed[7]，但由于其四聚體的特性限制了其在生物技術領域中的應用[8-9]。

近年來，蛋白質工程學已經成功地將天然熒光蛋白的激發光譜擴展到整個可見光波段甚至遠紅外波長，從而產生了一系列熒光蛋白[10]。當使用FPs時，通常需要同時成像多個光譜通道的圖像以分析多種生物活動，或在定量研究中使用一個熒光團作為參照[11]，所以豐富多樣的熒光蛋白對生物學研究的推動作用顯而易見。橙色熒光蛋白的出現使熒光蛋白家族的光譜范圍進一步完善，它具有與常用的紅色以及綠色熒光蛋白顯著差異的發射波峰，使研究者在進行多熒光標記等實驗時具有更多樣的選擇。同時它具有在顯微鏡下細胞自身熒光背景較暗、光散射較少、可用于活體組織成像、發射波長較長等優勢。因此，現在更多的研究集中在橙色FPs的開發中。

1 橙色熒光蛋白的種類及其特點

1.1 常規橙色熒光蛋白

目前報道的常規橙色 FPs主要來源于兩種親本蛋白：Kusabira-Orange (KO)[12]、DsRed[13]。KO最初是從石質珊瑚Fungia concinna中分離出來的，通過在其N端引入10個氨基酸殘基從而可為蛋白質提供明亮的橙色熒光[12]，KO激發和發射峰分別為548 nm和561 nm[14]。但由于KO是四聚體結構，后來又通過引入另外22個氨基酸突變得到了一個單分子變體mKO，其保持了原有的亮度和熒光特性，最大發射峰略有變化 (559 nm)，分子量為28.1 kDa[14]。mKO被進一步改進，產生兩個亮度更高的變體 (mKO2[15]和mKOk[16])。

DsRed衍生物中橙色FPs最多，共有8種，Shaner等在DsRed的單分子變體mRFP1[17]基礎上改進得到了mHoneydew、mBanana和mOrange[18]。mOrange的亮度比同為DsRed衍生物的mCherry[18]要高出3倍以上。雖然mOrange的亮度較高，但它對酸的敏感性也非常高，pKa值為6.5。mOrange的高消光系數和高量子產率使其成為潛在的熒光共振能量轉移技術 (Fluorescence resonance energy transfer，FRET) 受體。隨后，Shaner等又在mOrange的基礎上，開發出mOrange2[19]，其光穩定性是mOrange的25倍以上。此外，Strack等通過改造 DsRed獲得一種低細胞毒性的四聚體紅色FPs——DsRed-Express 2[9,20]，并以此蛋白作為模板，在保留其低細胞毒性的基礎上創造了橙色變體E2-Orange。

1.2 具有特殊表型的熒光蛋白

此外，還有一些具有獨特表型的橙色 FPs，具有大斯托克位移 (Large stoker shift，LSS) 的橙色 FPs有兩種：LSSmOrange[21]以及亮度更高的CyOFP1[22]，LSSmOrange是在mOrange的基礎上突變得到的變體，CyOFP1是在mNeptune2的基礎上定向突變得到，具有激發光為綠色以及高亮度的特點。除此之外還有具有從橙色到遠紅色熒光態的光轉化特性的 FPsPSmOrange和PSmOrange2[23]。

另外，在FPs發色團中還有一種被稱為光敏劑的發色團，這種發色團被光照射后能夠產生活性氧(ROS)，進而滅活目的蛋白，即發色基團輔助光失活 (Chromophore-assisted light inactivation，CALI)技術[29-30]，對 DNA、蛋白質、脂肪等造成損傷，影響細胞的代謝或增殖，誘導細胞死亡[31]。Sarkisyan等報道了一種紅色 FPsKillerRed的橙色突變體KillerOrange，當其被藍光或綠光照射時，它會產生ROS從而殺傷細胞[32]，所有熒光蛋白特性羅列在表1中。

2 橙色熒光蛋白結構的研究

2.1 蛋白質結構

大部分橙色熒光蛋白具有相似的 β-桶狀的結構。以 mKO 為例 (圖 1)，11個 β-折疊鏈組成 β-筒的外周結構，筒兩端分別被一些分子量較小的短α-螺旋覆蓋，組成發色團的 3個氨基酸殘基與 α-螺旋共價相連，位于圓筒中央螺旋中部。β-圓筒與短 α-螺旋形成致密的結構域，使配體不能擴散進入，發色團被嚴格保護在筒內，從而形成穩定的結構，不易猝滅[33]。

2.2 發色團的結構

通過研究，FPs發色團自成熟和光誘導化學的基本原理已經相對清楚[34]。FPs的光譜特性是由其發色團的結構決定的，橙色熒光蛋白的發色團由3個氨基酸殘基組成，后兩個較為保守，一般為酪氨酸和甘氨酸，第一位的氨基酸變化最大，也是此位氨基酸的側鏈發生環化，形成特殊的三環發色團結構，從而擴展電子共軛體系為熒光蛋白提供橙色的熒光[18]。

表1 橙色熒光蛋白及其特性Table 1 Orange fluorescent protein and its characteristics

圖1 mKO的三維結構[33]Fig. 1 Representation of the three-dimensional structure of mKO[33].

mKO和KO具有相同的發色團結構，發色團都由C-Y-G三肽組成 (圖2A)，Cys發生環化形成第 3個環，擴展了顯色團共軛體系[35]。DsRed的發色團由 Q-Y-G組成，連接發色團的咪唑啉酮環和前一位氨基酸殘基的?；鶃啺坊鶊F擴展了共軛體系從而導致了紅色的熒光，DsRed中發色團的氨基酸殘基的改變產生了3種橙色FPs：mHoney-dew(M-W-G)、mBanana (C-Y-G) 和 mOrange (T-Y-G)。在mOrange中，位于66位的Gln被Thr取代，從而形成色團中第 3個雜環 (惡唑環)，導致橙色的光譜特性 (圖2B)[7,34]。在DsRed-Express2的橙色衍生物E2Orange的設計中，將相同的Q66T突變體引入 DsRed-Express2中，從而產生了橙色的激發和發射峰。值得一提的是mHoneydew的發色團的結構很特別，與其他 DsRed衍生物不同，它的發色團中的Tyr被取代為Trp (圖2C)，但是這個特殊的結構并沒有給它帶來良好的熒光表現，它的熒光強度只有 DsRed的 3%，包括同為衍生物的mBanana，它們的特性都不是很良好，所以應用的實例也較少。

圖2 橙色熒光蛋白的發色團結構[36]Fig. 2 The structure of the chromophore of the orange fluorescent protein[36].

2.3 關鍵位點突變對二級結構的影響

LSSmOrange、PSmOrange和 PSmOrange2與親本 mOrange具有相同的顯色團結構。它由對羥基苯基、咪唑啉酮和由T66側鏈環化的2-羥基二氫惡唑環組成。在LSSmOrange中，大斯托克位移的產生源于分子內部的激發態質子轉移[21]，而包括I161D、M163L和W143M在內的關鍵突變對發色團周圍環境造成顯著影響從而為激發態質子轉移的發生提供條件 (圖 3)。W143M 置換使 L165側鏈向蛋白的內部轉移，W143M和 M163L均使發色團的結構趨向扁平，由這兩個突變引起 S146側鏈構象的改變，從而使S146可以作為從發色團的對羥基苯環到D161的羧基之間激發態質子轉移的中間傳遞體[36]。與LSSmOrange不同，CyOFP1的大斯托克位移源于K160與發色團的酚基團之間的氫鍵，激發態質子從發色團傳遞到K160的側鏈從而完成激發態質子的轉移[22]。

在 PSmOrange和 PSmOrange2中，Q64L突變對于其光轉換特性至關重要。這種突變破壞了64位谷氨酰胺和95位精氨酸之間的氫鍵，Y99側鏈羧基與I60主鏈羰基形成新的水介導的氫鍵。這兩種變化導致的蛋白質可以被氧化劑或光刺激，從而轉化為遠紅外的發光狀態 (圖4)。光轉換伴隨著65位 Phe/Ile (PSmOrange/PSmOrange2) 上 Cα1-C鍵的斷裂，使畸變的顯色團恢復，并將 2-羥基二氫惡唑氧 OH-基團轉化為 C=O，使發色團共軛體系得到擴展。這是PSmOrange和PSmOrange2中大量(約90 nm)熒光紅移的主要原因。PSmOrange2中A217S的取代使215位Glu向發色團靠近，并使其與發色團形成氫鍵，增加了發色團的極化和量子產率[36]。

圖3 mOrange與LSSmOrange的結構差異[36]Fig. 3 The difference between mOrange and LSSmOrange[36].

圖4 mOrange與PSmOrange的結構差異[36]Fig. 4 The difference between mOrange and PSmOrange[36].

KillerOrange以及mKillerOrange是KillerRed的突變體，三肽結構為Q-W-G，Trp替換KillerRed發色團中的 Tyr，在這兩種 FPs中，發色團的第66位Trp與第159位Gln形成氫鍵，以維持一種不尋常的反式-順式結構。這種順反式構象與沿著β-桶軸從發色團延伸到筒體末端的充水通道是關鍵的結構特征，這兩者為兩種光敏劑提供了明亮的橙色熒光和光毒性[37]。

3 橙色熒光蛋白的應用

3.1 橙色熒光蛋白作為標記蛋白的應用

橙色熒光蛋白所在的發射光波段，在某些特殊細胞中可以有效避開細胞自身的背景熒光。除此之外，橙色熒光在哺乳動物的深部組織成像優勢巨大，因為相關組織對橙光及紅光的通透性較好。某些變體自身的優異特性也使其成為標記蛋白的良好選擇，比如大斯托克位移FPs在多熒光標記中的應用。

3.1.1 在微藻及植物中的應用

藍藻作為可以用于生物燃料和化學合成應用的模式生物越來越受到關注[38]，藍藻自身攜帶大量的光合色素，當對藍藻進行熒光標記時，這些光合色素會與FPs競爭吸收激發光源，吸收FPs發射的熒光，并且放出自身熒光信號干擾檢測，所以選擇合適的標記蛋白對藍藻的熒光標記至關重要。Ruffing等選擇mOrange作為標記蛋白，探索其在Synechococcussp. PCC7002中的標記性能，結果顯示可以在光譜圖上區分轉基因型和野生型藍藻。這為使用 mOrange作為藍藻生物中的標記蛋白提供參考和依據[39]。之前的研究也表明，橙色和紅色FPs適合萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii[40]的胞質表達。

除此之外，橙色FPs也在植物中作為標記蛋白來使用。Mann等將mOrange等6種FPs基因分別轉入煙草和擬南芥中進行表達。結果顯示橙色熒光蛋白可以用于植物轉化[41]。在豆科植物中，過多的根瘤形成會抑制植物生長。植物激素脫落酸(ABA) 可以抑制根瘤的形成，ljglu1基因是一種ABA反應基因。Osuki使用mOrange標記LjGlu1蛋白，從而觀察其在根組織和結節中的定位[42]，表明LjGlu1的表達是植物自身對根瘤菌感染作出的應激反應，并在根組織外發揮作用，從而抑制感染。發動蛋白和網格蛋白參與植物包膜囊泡的形成，Fujimoto等用GFP和mKO分別標記參與其中的發動蛋白以及網格蛋白，根據它們的聚集狀況從而觀察它們在植物內吞過程中的分子機制[43]。

3.1.2 在哺乳動物細胞中的應用

Ⅱ型糖尿病是一種非胰島素依賴型糖尿病，葡萄糖轉運體4 (GLUT4) 是將葡萄糖轉運入細胞的主要蛋白之一，是治療Ⅱ型糖尿病的靶點，其廣泛分布于骨骼肌、心肌、脂肪組織、腎臟和大腦[44]。Zhao等通過構建融合表達mOrange和GLUT4的細胞株系，從而觀察細胞內GLUT4動態變化及其與質膜融合狀況[45]。在鳥類和哺乳動物的皮膚色素沉著過程中，黑色素在黑素細胞中合成，然后轉移到鄰近的角質形成細胞中，使含有黑色素的細胞覆蓋全身。Murai等用EGFP和mOrange分別標記黑素細胞以及角質形成細胞，探索兩種細胞間的相互作用[46]，以了解細胞間相互作用機制以及體內皮膚色素沉著規律。

值得一提的是，CyOFP1的激發光為綠色，發射光為橙色，其開發者Chu等[22]利用這一特性，將其與綠色熒光蛋白分別標記到黑素瘤細胞的不同部位，從而通過單一的激發光源同時觀察兩個光通路的蛋白標記狀況，這節省了布置雙激光發射器的成本。

3.1.3 在病毒中的應用

Etienne等將包括mOrange在內的多種FPs融合到單純皰疹病毒1型 (HSV-1) 菌株的小衣殼蛋白 (VP26) 上，并且進入人黑色素瘤細胞進行擴增，從而探究病毒在體內的感染機制[47]。Chen等在竹花葉病毒 (BaMV) 感染宿主的過程中發現了一個上調的基因，該基因編碼的蛋白包括一個環狀結構與一個跨膜結構域，該蛋白可能具有泛素 E3連接酶的功能，并將其命名為泛素 E3連接酶(NbUbE3R1)。實驗者將其與橙色FPs融合表達，進一步研究 NbUbE3R1在 BaMV積累中的功能作用[48]。

3.2 橙色熒光蛋白在FRET技術中的應用

基于熒光壽命成像顯微鏡 (FLIM) 的熒光共振能量轉移 (FRET) 測量正越來越多地用于探索生命系統中的分子構象和分子間相互作用。在適當位置的受體存在的情況下，可以根據供體熒光團的興奮狀態時間的縮短來判斷其標記的蛋白質之間的分子構象。傳統的青色 FPs由于其耐光性差、低量子產量等缺點在熒光共振成像中的應用還達不到理想的效果[49]，mOrange、mKO等由于其較高的消光系數和量子產率使其具有成為FRET受體的潛力，有望成為優秀的FRET。近幾年來使用mOrange作為熒光受體的研究越來越多，為研究細胞內生物大分子相互作用以及探究生命過程提供有效工具。

Ke等通過將mOrange連接到哈氏弧菌熒光酶素α亞基的N端，從而使該融合蛋白獲得了新的560 nm的發射峰。這為通過將熒光素酶與其他合適的 FPs或發色團共價結合來改變細菌的生物發光顏色提供思路[50]。De等開發一種結合mOrange和熒光酶素的自發光融合蛋白 (BRET3)，新的融合蛋白在光強上提升了幾倍，且能解決體內熒光成像等相關問題[51]。這兩種應用都是將熒光酶素與FPs結合使用，利用熒光酶素本身利用生物底物發光的性質以及橙色 FPs的高消光系數和高量子產率的優勢進行創新的熒光標記手段，具有巨大的應用前景，可以為后人的實驗設計提供新的思路。

植物依靠肌動蛋白細胞骨架來驅動基本的細胞活動，這對它們的正常生長和發育至關重要，包括與細胞分裂、細胞膨脹和膜重構等相關的生命活動[52]。Bayle等報道了在完整植物細胞中使用綠色FPs突變體TSapphire作為mOrange的熒光供體的應用。嵌合連接的TSapphire和mOrange之間發生大量的能量轉移，導致 TSapphire熒光壽命縮短。并且驗證了該系統在不同的亞細胞中的通用性[49]。

視網膜鳥苷?；h化酶激活蛋白 (GCAPs)可以調節人類的視覺光反應。Peshenko等對整個GCAP1蛋白表面殘基進行誘導突變，并用mOrange標記，在細胞基礎上測試每個突變體與GFP標記的視網膜鳥苷?；h化酶的體外結合以及激活能力，從而探索GCAPs與其靶酶相互作用的關鍵位點[53]。研究發現 Orai1蛋白以及 STIM1蛋白構建的 Ca2+儲存通道在 Ca2+進入及信號傳遞中發揮重要作用[54]。Huang等用EGFP標記Orai1作為熒光供體，mOrange標記STIM1作為熒光受體在大鼠神經細胞中表達，探索兩者之間的相互作用[55]。肌動蛋白細胞骨架參與多種生物過程，包括T細胞活化[56]。Larbret等將EGFP和mOrange分別融合到T細胞株的肌動蛋白上，當游離的G肌動蛋白互相連接組成 F肌動蛋白時，靠近的EGFP和mOrange之間發生能量轉移，從而觀測活細胞中G肌動蛋白和F肌動蛋白之間的動態平衡[57]。Goedhart等構建mKO-mCherry FRET受體供體對，用于檢測活細胞中NF-kB轉錄因子復合物亞族p65的同源二聚化，具有比CFP-YFP受體供體對更高的 FRET效率[1]。表明在單個活細胞中，基于紅色 FPs的 FRET方法更適合于檢測蛋白質之間的相互作用。

4 總結與展望

本文主要介紹了橙色FPs的研究和發展，以及其在蛋白標記、FRET、生物傳感器等方面的運用。隨著對FPs晶體結構研究的深入，人們大大提高了對于熒光發色團的認識。通過對一些優秀突變體的結構分析，我們了解了一些能夠引起FPs性質改變的關鍵位點。結合目前現有的橙色 FPs以及待發現的野生型橙色 FPs，相信可以設計和研發出更多可應用的突變體?，F有的常規橙色FPs如mOrange、mKO具有較高的消光性質和量子產率，在FRET中有巨大的應用前景。除此之外還有很多創新的應用，比如FPs與生物熒光酶素的融合表達也趨于流行，以及大斯托克位移的 FPs如CyOFP1在多熒光標記中的應用。有理由相信，橙色FPs將會與眾多FPs一起在未來的生物學研究中起到重要作用。