鯊源單域抗體的研究進展

劉星，陳奇

海南大學 食品科學與工程學院，海南 ?？?570228

自Kohler和Milstein[1]發明雜交瘤技術以來，理化性狀均一、生物活性單一的單克隆抗體被廣泛應用于免疫檢測、醫學診斷以及疾病治療等領域。其中，首個抗體藥物抗CD3抗體 (OKT3) 于1986年通過美國 FDA的審查，隨后，由于靶向性好、副作用小等優點，抗體藥物逐漸成為生物制藥行業發展最快的種類之一。到2018年底，據不完全統計已有69種抗體藥物通過FDA批準上市[2-3]。據Grilo及Mantalaris統計，2017年抗體藥物的市場銷售額為980億美元，預計到2022年銷售額將達到1 370億至2 000億美元，領跑所有的生物類藥物[3]。

回顧整個抗體應用 (藥物及免疫試劑) 的發展歷程，可以發現傳統抗體的固有屬性一直是制約其發展的關鍵因素。首先傳統抗體尺寸大，難以穿越腫瘤組織以及人體屏障，限制了抗體藥物的應用范圍。其次，傳統抗體結構復雜、穩定性差，導致其作為免疫試劑時易失效，從而限制了相關抗體試劑的應用領域。為了克服上述問題，通過基因工程技術對傳統抗體進行了多種形式的小型化改造，先后開發出了抗體可變區片段(Antigen-binding fragment，Fab)、單鏈抗體(Single-chain variable fragment，ScFv) 等小分子抗體，然而這些小分子抗體往往表現出較差的穩定性以及親和力[4-5]。

1993年天然缺失輕鏈的重鏈抗體 (Heavychain antibodies，HcAbs) 首先在駱駝科動物中被發現[6]。隨后，1995年，在護士鯊Ginglymostoma cirratum體內發現了具有類似重鏈抗體結構的免疫球蛋白，被稱為IgNAR[7]。HcAbs及IgNAR的發現為抗體小型化研究提供了新的發展方向，并引發了對單域抗體 (VHH及 VNAR) 的研究熱潮。單域抗體所固有的分子量小、親和力高、穩定性強、溶解度好、組織穿透性強以及可識別隱藏抗原表位等優點使其在免疫檢測[8]、醫學成像[9]、體外診斷[10-11]以及疾病治療[12-13]等領域中受到廣泛的關注。由于駱駝科動物的飼養較鯊魚更為容易等原因，早期對單域抗體的研究主要集中于駱駝科動物。目前國內外已有大量文獻綜述了VHH的結構及功能特性及其在各領域的應用。近年來針對鯊源單域抗體的研究日益增多，對其結構及功能的認識不斷加深，應用也日漸廣泛。但是，目前國內未見關于鯊源單域抗體的綜述報道。因此，文中詳細綜述了鯊源單域抗體的結構及功能特性、制備及人源化改造技術、親和力成熟策略以及應用領域，并系統性分析了鯊源單域抗體的優缺點，最后對其發展前景進行了展望。

1 IgNAR的發現

20世紀 60年代首次證明，鯊魚能夠對抗原刺激產生保護性免疫應答[14]，表明其存在適應性免疫系統。首先在鯊魚體內發現的免疫球蛋白為IgM，其具有2種不同沉降系數 (19S及7S) 的類型。其中，7S型IgM的親和力經免疫后會提高，并且存在記憶效應[15-16]。第2種被發現的免疫球蛋白為IgW，其與高等脊椎動物IgD同源性較高。分泌型IgW存在2種類型，分別包括3個和7個結構域[17]。

1995年，Andrew等在護士鯊體內發現了不同于IgM和IgW的新型免疫球蛋白IgNAR，其最初被發現與T細胞抗原受體 (T cell receptor，TCR)同源性較高，從而被命名為新抗原受體(New antigen receptor，NAR)[7]，但是后續研究發現該分子與免疫球蛋白存在諸多類似的結構及功能特性，因此被重新命名為IgNAR[18]，IgNAR與傳統抗體不同，它是由2條重鏈組成的同源二聚體，缺乏輕鏈 (圖1)。與經典的B細胞受體一樣，IgNAR以分泌型和膜結合型的形式存在，由被稱為 VNAR的可變區和不同數量的恒定區組成。其中，分泌型IgNAR具有5個恒定區[19]。IgNAR在適應性免疫中的作用由Dooley等首次證實，其以雞卵清溶菌酶 (HEL) 為抗原免疫護士鯊，經過長達3年的監控，發現在多次間隔免疫之后，護士鯊產生了快速且顯著增強的IgNAR免疫應答反應[20]。

2 IgNAR的起源及進化

軟骨魚綱 (Chondrichthyes) 是與哺乳動物在進化上距離最遠的具有真正適應性免疫系統的脊椎動物，由全頭亞綱 (Holocephali) 和板鰓亞綱(Elasmobranchii) 組成[21]。其中板鰓亞綱可分為鯊總目 (Selachimorpha) 和鰩總目 (Batoidea)[22]。

圖1 不同類型抗體的結構示意圖Fig. 1 Schematic diagram of different types of antibodies.

2006年 Criscitiello等在護士鯊等體內發現NAR-TCR的存在[23]。最初認為，NAR-TCR是IgNAR基因簇和 TCR位點基因重組的產物。但是，2007年Venkatesh等對全頭亞綱魚類象鼻鯊Callorhinchus milii的全基因組數據分析，只發現了NAR-TCR的存在，而沒有找到IgNAR存在的證據[24-25]，表明NAR-TCR的出現早于IgNAR，因此推測IgNAR的可變區可能源于NAR-TCR。同時由于IgNAR中最后4個恒定區與IgW的恒定區同源性較高，因此有學者認為在 2.2億年前軟骨魚綱分化為全頭亞綱和板鰓亞綱前后，NAR-TCR與IgW發生基因重組，并丟失CH1，導致在板鰓亞綱魚類 (鯊、鰩) 中出現了IgNAR[23,26-27]，因此基于IgNAR所開發的VNAR包括鰩源及鯊源2種。至于VNAR的起源，到目前為止依然沒有定論，因為它與任何已知的抗原受體都沒有很高的相似性[28]。

據不完全統計目前鯊總目存在超過450個不同的種[29]，鰩總目存在約560個不同的種[22]，由此可知板鰓亞綱魚類種類遠多于駱駝科動物，為VNAR的開發提供了豐富的材料，由于當前針對VNAR的研究集中于鯊總目，為敘述方便，本文所述VNAR特指鯊源單域抗體。

3 IgNAR的多樣性來源

與在其他脊椎動物中發現的轉座子 (VnDnJnC)基因系統不同，板鰓亞綱魚類的免疫球蛋白(IgM、IgW和IgNAR) 基因以基因簇 (VDJC)n形式存在 (圖 2)。每個基因簇由 1個 V基因片段(Variable gene segment)、多個 D基因片段(Diversity gene segment)、1個 J基因片段 (Joining gene segment)和恒定區外顯子組成[30-31]。IgNAR也由基因簇中的基因編碼，其每個基因簇中含有3個D基因片段，因此通常需要4次基因重排，才能產生 1個完整的 VNAR基因序列[30]。由于IgNAR不含輕鏈，缺少重鏈和輕鏈的組合多樣性，同時IgNAR基因簇數量較少，因此IgNAR最主要的多樣性來源于長且高度突變的 CDR3區[32-33]。同時，CDR1、HV2和HV4區的突變也能增加IgNAR的多樣性[34]。此外對 VNAR的結構分析表明，非典型半胱氨酸殘基的數量及位置的不同會導致VNAR抗原結合區的構象存在巨大的差異[35-37]。因此，VNAR中的二硫鍵不僅可以增加結構的穩定性，還能產生各種各樣的構象，從而進一步擴展IgNAR的多樣性。

圖2 高等脊椎動物和板鰓亞綱魚類免疫球蛋白基因的轉座子及基因簇排列方式比較Fig. 2 Comparison of transposons and cluster arrangement of immunoglobulin genes in higher vertebrates and elasmbranchs.

4 VNAR的類型

根據CDR區和FR區中非典型半胱氨酸殘基及保守色氨酸殘基的位置和數量可以將VNAR劃分為不同的亞型[38]。到目前為止，已經定義了3種主要的VNAR，分別稱為類型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ[39-40]。此外有些VNAR只包含2個高度保守的典型半胱氨酸殘基，Liu等[41]和Streltsov等[28]將這些VNAR稱為Ⅱb型。同時將在 CDR1區含有保守色氨酸殘基以及只含有典型半胱氨酸殘基的VNAR稱為Ⅲb型[38]。所有當前命名的VNAR類型見圖3。此外，2019年Feng等[42]通過對約119萬條來源于護士鯊的VNAR序列分析發現，護士鯊中存在約5%其他類型的VNAR，其不含或只含有1個半胱氨酸殘基。

迄今為止，Ⅰ型VNAR只在護士鯊中被發現，可能為該物種所特有[40]。該亞型 VNAR分別在FR2和FR4區中存在2個非典型半胱氨酸殘基，同時在CDR3區中也存在2個以上的半胱氨酸殘基。晶體結構分析發現，FR2和FR4中存在的半胱氨酸殘基會與CDR3中的2個半胱氨酸殘基分別形成二硫鍵，從而形成1個緊密結構[37](圖3)。需要注意的是，Ⅰ型VNAR由于二硫鍵的束縛導致CDR3區形成的指凸結構的長度較短，難以識別蛋白裂隙深處的抗原表位[36]。

圖3 不同類型的VNAR示意圖 (左側為VNAR序列的特征圖，其中黑點為典型半胱氨酸殘基，白點為非典型氨基酸殘基，黑色實線和虛線為二硫鍵. 右側為不同類型VNAR的三維結構模型，其是利用Pymol軟件對已報道的VNAR序列[41,44]進行同源建模而獲得)Fig. 3 Schematic diagram of different types of VNAR. The characteristic diagrams of VNAR are on the left. The canonical cysteine residues (black dots), non-Canonical cysteine residues (white dots), disulphide bonds (solid and dashed lines), and conserved tryptophan (W) are shown in their relative positions. The three-dimensional structural models of different types of VNAR are on the right, which are obtained by homology modeling of reported VNAR sequences[41,44] using Pymol software.

Ⅱ型VNAR與Ⅰ型的不同之處是CDR1區和CDR3區中的2個非典型半胱氨酸會形成二硫鍵，使上述區域靠近，同時CDR3區可形成1個較長的指凸結構，從而易于與蛋白裂隙等隱藏抗原表位結合。迄今為止，在所有研究的鯊魚中都發現了Ⅱ型VNAR[40]。

Ⅲ型VNAR與Ⅱ型類似，在CDR1和CDR3區分別存在1個非典型半胱氨酸，此外該亞型在CDR1區半胱氨酸殘基附近存在 1個保守的色氨酸殘基。需要注意的是Ⅲ型VNAR的多樣性較低。據推測，Ⅲ型VNAR是保護新生鯊魚抵御常見病原體的早期廣譜抗體，通常只在幼鯊 (<1歲) 中表達[32]。除Ⅲ型 VNAR外，所有類型的 VNAR都能產生高親和力[43]。

5 VNAR的主要特性

5.1 結構特性

VNAR與哺乳動物傳統VH及駝源動物VHH在結構上最大的不同是，其缺乏包含有CDR2區的C′和C″的 β鏈，同時在C-D和D-E的β鏈之間分別存在額外的高變區 (HV2和HV4) (圖4)。2條 β鏈的缺失，使得 VNAR的分子量約為12 kDa，比VHH小約20%，是已知脊椎動物中尺寸最小的抗原結合域[37,43]。

基于有限的VNAR晶體結構可知[36-37,44-45]，HV2區通常與CDR1、CDR3以及HV4區距離較遠 (圖 5)，有可能作為獨立抗原結合區而存在。Zielonka等[46]以上皮細胞粘附分子 EpCAM 特異性VNAR為模板，通過隨機化HV2區 (包含9個氨基酸殘基) 構建了酵母展示文庫，經淘選獲得特異性針對細胞表面分子 CD3ε以及人 Fcγ的VNAR，新分離獲得的 VNAR依然保留了識別EpCAM的高親和力。該研究表明同一VNAR的不同區域可以作為獨立的抗原識別區識別不同的抗原。更為重要的是，該研究為雙特異性抗體的開發提供了新思路。

圖4 VH、VHH和VNAR結構示意圖Fig. 4 Structural schematic diagram of VH, VHH and VNAR.

圖5 不同類型VNAR與HEL結合模擬圖[36]Fig. 5 Simulation on the interaction between different types of VNAR and HEL[36].

5.2 功能特性

5.2.1 識別隱藏表位

針對一系列抗酶抗體的研究發現，傳統抗體與單域抗體可能優先識別不同的抗原表位[37,47-48]。這主要是因為傳統抗體的 VH-VL界面通常是平面或者凹面，無法識別蛋白裂隙等隱藏抗原表位，而單域抗體的CDR3區通常較長，可以形成指凸結構，從而能夠深入到酶活性中心等蛋白裂隙。目前有限的VNAR與酶免疫復合物的晶體結構研究證實了上述觀點，VNAR的CDR3區可以深入酶活性中心[37](圖5)。

不僅酶活性中心，VNAR也能識別其他折疊蛋白的裂隙。惡性瘧原蟲頂端膜抗原 1 (AMA1)是一種重要的蛋白抗原，存在于目前所有已驗證的瘧原蟲中，其含有1個進化上保守的蛋白裂隙。Nuttall等利用半合成庫，淘選得到AMA1特異性的 VNAR，命名為 12Y-2[49]。隨后作者對 12Y-2進行一系列突變，并對2株突變體與AMA1的晶體結構進行研究，結果顯示，VNAR的CDR3區能夠深入到AMA1的疏水裂隙中[44]。因此有學者認為識別裂隙等隱藏抗原表位可能是單域抗體的基本特征[47]。

5.2.2 高水溶性和穩定性

IgNAR 可在含有 350 mmol/L尿素和1 000 mOsm/kg滲透壓鹽離子的鯊魚血液中保持生物活性，主要是因為 IgNAR具有極強的穩定性[50-51]。通常認為IgNAR的穩定性可以歸因于以下 2個因素：1) 高水溶性，與傳統抗體 VH-VL界面相比，VNAR帶有大量的帶電和親水氨基酸殘基，如 Tyr37、Glu46、Lys82、Gln84、Arg101和Lys104，其中Glu46、Lys82和Lys104氨基酸殘基的保守性最強，其通過相互之間以及與水分子之間的氫鍵形成1個帶電的內陷結構。此外Tyr37作為免疫球蛋白超家族的保守氨基酸殘基與 Gln84、Arg101參與形成CDR3區與FR區的氫鍵網絡，最終使得VNAR形成親水性界面，提高溶解性并保護保守的免疫球蛋白疏水性骨架[28]；2) VNAR的特殊結構，Buchner等發現與哺乳動物抗體相比，VNAR包含1個額外的鹽橋和延伸的疏水核。將這些增強穩定性的結構轉移到人抗體的可變區之后，可顯著提高其穩定性[52]。此外VNAR內部的二硫鍵也有利于提高其穩定性[28,37,51]。

5.2.3 較強的組織穿透性

由于眼部特殊的構造，抗體等大分子藥物通常只能通過玻璃體注射等方式給藥，往往存在感染以及視網膜脫落等副作用。因此，急需開發組織穿透性強的藥物，以便改變給藥途徑。葡萄膜炎是眼科常見的致盲性疾病，其成因復雜，多屬于自身免疫性疾病。誘導共刺激因子配體 (ICOSL)與共刺激因子 (ICOS) 相互作用，在T細胞活化過程中起著重要作用。通過阻斷這種相互作用可以抑制T細胞的完全活化，從而改善疾病癥狀。Kovaleva等[53]利用 ICOSL免疫的護士鯊建立免疫庫，并淘選得到特異性識別ICOSL的VNAR。作者利用角膜劃傷的小鼠模型研究了VNAR穿越組織的能力，通過滴加的方式給小鼠模型用藥，藥物包括 VNAR、VNAR-Fc以及 mAb，給藥20 min之后，只有VNAR可以穿透角膜，在小鼠眼睛的前房被發現。該結果顯示了VNAR具有較強的組織穿透性。

6 VNAR的制備技術

6.1 免疫庫

制備免疫庫首先需要對鯊魚等動物進行免疫，目前用于產生高親和力IgNAR的免疫方案已有報道[54-55]。然而，與哺乳動物相比，鯊魚的免疫周期通常較長[27,38]。Dooley等以雞蛋溶菌酶(HEL) 為抗原免疫護士鯊，建立了首個VNAR噬菌體展示免疫文庫，并從中淘選獲得多株VNARs，其中性能最好的被命名為5A7，其親和力為20 nmol/L[20]。需要注意的是，并不是所有測試的鯊魚種類都能產生適應性IgNAR免疫應答。Crouch等[56]以人血清白蛋白 (HSA) 以及HEL作為抗原免疫斑點貓鯊Scyliorhinus canicula，經過長達37周的免疫程序，沒有發現機體產生抗原特異性IgNAR的證據。

6.2 天然庫

由于天然庫缺乏免疫過程中刺激機體所發生的體細胞突變，導致使用該策略淘選得到的VNARs的親和力通常較低。不過使用數量較多的動物，通過增加文庫庫容以及多樣性的方式，有助于淘選獲得高親和力的 VNARs。Feng等[42]基于EASeL技術用6條護士鯊構建噬菌體展示天然庫，其庫容可達 1.2×1010，作者從該天然庫中淘選獲得特異性識別癌癥治療相關抗原 (GPC3、HER2和PD1)、病毒刺突蛋白 (SARS和MERS)以及假單胞菌外毒素 (PE38) 的 VNARs，其中1個識別 PE38的 VNAR具有較高的親和力(10.1 nmol/L)。該研究表明利用庫容大、多樣性豐富的天然庫也可淘選得到高親和力的VNAR。

6.3 半合成庫

隨著對VNAR結構及功能的認知，發現體內VNAR的多樣性主要來源于長且高度突變的CDR3區。因此以VNAR作為框架，通過CDR3區的隨機化構建半合成VNAR文庫，可以獲得類似甚至優于天然庫的效果。Nuttall等以斑紋須鯊Orectolobus maculatesVNAR為框架，通過隨機化CDR3區 (包含16或者18個氨基酸殘基) 構建了第1個VNAR噬菌體展示半合成文庫，并利用其淘選得到針對 AMA1的 VNAR，其親和力為200 nmol/L[57]。

7 VNAR的親和力成熟策略

7.1 隨機突變

Nuttal等[49]利用易錯 PCR在針對 AMA1的VNAR (12Y-2) 的CDR1和CDR3區進行隨機突變并建立突變庫，隨后通過嚴格淘選，使得VNAR突變株的親和力提高了10倍。此外該研究團隊還利用來源于Qβ噬菌體的低保真RNA聚合酶以及核糖體展示文庫技術構建突變庫，通過嚴格淘選，使得VNAR突變株的親和力提高了23倍[58]。

7.2 定點突變

Fennell等[59]以HEL特異性結合的VNAR為模型，利用核糖體展示技術以及易錯 PCR對VNAR序列中各氨基酸的功能進行了系統性研究。通過反復突變以及淘選，獲得320個含有突變氨基酸并保留抗體活性的序列，經測序及分析，作者確定了保持結構及功能完整性的關鍵位點、與親和力密切相關的位點以及允許高度突變的位點。其中3個位點氨基酸的突變 (A1D、S61R和G62R) 可以提高親和力，最終結合這3種突變，使VNAR突變體的親和常數達到460 pmol/L，比野生型5A7提高了20倍。該工作通過對VNAR序列中各氨基酸功能的系統性研究，為VNAR的定點突變提供了參考。

7.3 分步式突變

Zielonka等[60]首先以條紋斑竹鯊Chiloscyllium plagiosumVNAR為框架，通過隨機合成 CDR3區 (包含 12個氨基酸殘基) 構建了酵母展示文庫，并以 3種腫瘤標志物上皮細胞粘附分子(EpCAM)、肝配蛋白A受體2 (EphA2) 以及人絲氨酸蛋白酶 (HTRA1) 為靶分子淘選 VNAR，經過 3輪淘選后，收集 VNARs并以其為模板隨機合成CDR1區 (包含5個氨基酸殘基)，并進行再次淘選。最后通過對淘選得到的 VNARs序列分析，發現針對EpCAM的3株VNARs擁有完全相同的CDR3區且與最初淘選得到的VNAR序列相同，通過親和力分析發現，CDR1區突變的 3株VNARs的平均親和常數為 11.2 nmol/L，比原始VNAR的親和力提高了 65倍。針對 HTRA1的VNAR也存在類似的現象。以上結果證明，通過對 CDR區的分步式突變可以獲得高親和力的VNAR，這種CDR區的分步式體外親和力成熟策略與護士鯊免疫系統中 IgNAR親和力成熟的過程類似。

8 VNAR的人源化改造

通過序列分析，發現VNAR與人源抗體可變區之間氨基酸的同源性約為25%–30%[61]，然而基于現有VNAR的晶體數據可知，VNAR的結構與人源抗體可變區的結構具有較高的相似度，因此可以通過框架移植實現對VNAR的人源化改造。目前首個被人源化改造的VNAR是由Müller等從人血清白蛋白 (HSA) 免疫的白斑角鯊Squalus acanthias噬菌體展示文庫中分離獲得，其最初被命名為 E06。E06自身并不能用于疾病治療，藥物分子通過與E06進行融合可以增加在血清中的半衰期，從而提高藥物的療效[62]。為了降低 E06的免疫原性，利用與VNAR相似度最高的人類免疫球蛋白可變區框架DPK9對E06進行人源化改造。結果發現，人源化E06的親和力及特異性得到了較好的保留。隨后該團隊以人源化huE06v1.10為模板利用易錯PCR進行隨機突變并構建突變庫，經過淘選獲得一系列突變株。作者利用樹突細胞-T細胞系統 (DC-T) 測試突變株的免疫原性，發現 BA11等突變株幾乎沒有免疫原性。最終基于親和力、免疫原性以及半衰期等數據，認為突變株 BA11最具臨床應用價值，并將其重命名為 NDure?[63-64]。

值得注意的是，除了上述傳統人源化改造技術外，Nuttall等基于VNAR晶體結構類似于免疫球蛋白超家族I-set類群的現象，提出以人源I-set類群分子 (如人類神經細胞粘附分子) 為模板進行VNAR的人源化改造，從而降低VNAR免疫原性的設想[65]。

9 VNAR的應用

VNAR所具備的分子量小、親和力高、穩定性強、溶解度好、組織穿透性強以及可識別隱藏抗原表位等特性，使得其在應用時具有產品質量穩定、生產成本低、易儲存以及貨架期長等優點，在藥物開發、體外診斷以及免疫檢測等領域受到廣泛的關注 (表1)。

表1 VNAR在各領域的應用Table 1 Applications of VNARs in various fields

9.1 VNAR在藥物開發中的應用

人腫瘤壞死因子 TNFα (rhTNFα) 是由免疫細胞分泌的一種小分子蛋白。細菌內毒素等刺激機體時會產生過量的rhTNFα，從而引發中毒性休克、腎上腺損害等嚴重疾病。因此，rhTNFα抑制劑的開發備受研究者的關注。Camacho-Villegas等[66]利用佛氏虎鯊Heterodontus francisci制備噬菌體免疫文庫，經過 4輪淘選分離獲得針對rhTNFα的VNAR，并命名為T43。通過細胞實驗證實T43具有中和rhTNFα的能力。同時利用脂多糖誘導的內毒素休克小鼠模型證實T43能顯著降低小鼠的死亡率。T43所表現出的良好的治療效果以及組織滲透性等，使其有潛力成為免疫治療藥物。

9.2 VNAR作為酶抑制劑的應用

抗體作為酶抑制劑時，可以通過改變酶活性位點構象或者直接結合酶活性位點等方式實現對酶活性的抑制[47]。Aurora-A激酶是一類進化上高度保守的蘇氨酸激酶，參與細胞有絲分裂過程，當其過量表達時，會導致出現非整數倍染色體，使得細胞增殖異常，最終誘發癌癥。因此，Aurora-A激酶抑制劑的開發受到廣泛關注。Burgess等[67]以斑紋須鯊VNAR為框架制備半合成庫，獲得特異性識別Aurora-A激酶的VNAR，命名為D01。晶體結構顯示D01通過破壞Aurora-A激酶的Lys-Glu鹽橋使得酶構象改變，從而失去活性。

Dooley等[37]利用雞卵清溶菌酶 (HEL) 免疫的護士鯊構建噬菌體免疫文庫，并淘選得到多株高親和力的VNARs，包括5A7等[48]。隨后Stan field等通過 5A7與 HEL共結晶的方式，系統性研究了VNARs的晶體結構以及5A7與HEL的結合，發現5A7中只有CDR1和CDR3區會與HEL接觸，且CDR3區的Arg100與Tyr101會深入到HEL的酶活性中心，從而抑制HEL的酶活性。

9.3 VNAR作為細胞內抗體的應用

乙型肝炎病毒前體蛋白在內質網中被加工成分泌型乙型肝炎病毒抗原 (HBeAg)，后者可引起慢性感染。Walsh等[68]以斑紋須鯊VNAR為框架制備半合成庫，并淘選到1株特異性結合乙型肝炎病毒前體蛋白的VNAR，命名為H6。為了評估H6作為細胞內抗體結合乙型肝炎病毒前體蛋白以減少 HBeAg分泌的效果，H6基因被插入到pCMV/ER表達載體，并轉入pTRE細胞中，通過蛋白印跡分析發現 H6能夠顯著降低前體蛋白及HBeAg的含量，表明VNAR能在真核細胞內的還原性環境下功能性表達并發揮效應，顯示了VNAR作為細胞內抗體的潛力。

9.4 VNAR在疾病診斷中的應用

早期診斷對于疾病的及時發現及治療至關重要，尤其是對于腫瘤等嚴重疾病。目前針對多種腫瘤標志物的VNAR被成功開發。Zielonka等[60]以條紋斑竹鯊VNAR為框架通過分步式隨機合成CDR3區和CDR1區，構建了酵母展示文庫，分別淘選得到識別 3種腫瘤標志物 (EpCAM、EphA2以及HTRA1) 的VNAR，其親和力都為納摩爾級，為后續建立免疫學檢測方法奠定了基礎。

9.5 VNAR在致病微生物檢測中的應用

Goodchild等[75]利用埃博拉病毒免疫的小鼠和護士鯊制備噬菌體免疫文庫，通過固相淘選法得到2株特異性識別病毒核蛋白 (Viral nucleoprotein，NP) 的VNAR，以及2株特異性識別埃博拉病毒基質蛋白 (Viral matrix protein，VP40) 的ScFv。其中NP蛋白與病毒 RNA形成復合物并被病毒包膜包裹，通常難以產生針對NP的傳統抗體。上述淘選結果證明 VNAR傾向于識別傳統抗體難以識別的抗原表位。作者發現VNAR與mAb及ScFv相比，對熱變性具有更強的抵抗力。VNAR在80 ℃條件下處理3 h依然能保留約50%的生物活性，而mAb及ScFv則分別在70 ℃以及50 ℃下處理3 h后完全喪失生物活性。VNAR優越的熱穩定性使其具有成為現場免疫檢測試劑的潛力。

9.6 VNAR在食品安全危害因子檢測中的應用

Liu等[76]以白斑角鯊VNAR為框架通過隨機合成不同長度的CDR3區構建了噬菌體合成文庫，利用固相淘選法，獲得特異性識別葡萄球菌腸毒素B(SEB)、蓖麻毒素 A (BoNT/A) 和肉毒桿菌毒素(Ricin) 的 VNAR。作者發現 VNARs針對 SEB、BoNT/A以及Ricin的最低檢測限分別是10 ng/mL、40 ng/mL以及1 μg/mL，展示了VNAR應用于食品安全危害因子檢測的潛力。

10 VNAR作為免疫試劑和治療藥物的優勢和劣勢

VNAR是目前在脊椎動物中發現的尺寸最小的抗原結合域，以下因素使其作為免疫試劑或藥物時具有優勢：1) 源于適應性免疫系統：IgNAR是板鰓亞綱魚類適應性免疫系統的重要組成部分。漫長的進化過程以及嚴酷的生理環境使得VNAR形成獨特的結構，具備極強的穩定性以及重折疊能力。同時通過抗原免疫利用IgNAR的體內親和成熟可獲得高親和力的VNAR。2) 尺寸小以及組織穿透性強：由于缺乏C′和C″的β鏈，導致 VNAR的分子量僅為 12 kDa。小尺寸使得VNAR作為藥物時，具有較強的組織穿透性[53,69]。3) 識別隱藏抗原表位的傾向：與駝源VHH類似，VNAR的CDR3區能形成指凸結構，識別傳統抗體無法識別的隱藏抗原表位。4) VNAR結構多樣性大：同為單域抗體的駝源 VHH僅存在類似于Ⅱ型VNAR的結構，即具有連接CDR1和CDR3的二硫鍵，而VNAR到目前為止至少存在5種不同的結構類型。因此，多樣化的VNAR結構為其識別不同類型的靶分子奠定了基礎。5) 與人類進化距離遠：由于鯊總目魚類與人類在進化上距離較遠，可用于開發針對保守的哺乳動物蛋白等靶點的抗體藥物。當前離臨床應用最近的NDure?，其靶分子即為保守的哺乳動物蛋白HAS。6) 易于大規模生產：VNAR結構簡單，由單基因表達，可以通過各種表達系統進行大規模生產，有利于降低成本。7) 商業競爭少：當前對于 VNAR的研究較少，沒有形成嚴密的專利保護。

當然，VNAR作為免疫試劑或治療藥物時也存在諸多不可回避的問題：1) 鯊魚飼養困難：普通實驗室飼養及免疫鯊魚存在較大困難。2) 免疫周期長：鯊魚免疫周期較長 (4–6個月)，而駱駝科動物則只需要3個月左右。較長的免疫周期會增加飼養成本以及抗體開發周期。3) 免疫原性大：由于鯊總目魚類與人類進化關系較遠，因此在開發基于VNAR的藥物時，VNAR可能存在較大的免疫原性，需要進行人源化改造。

11 結論與展望

VNAR是迄今為止在脊椎動物中發現的尺寸最小的抗原結合域。由于制備困難等原因，目前國內外對其研究較少，特別是國內，鮮有團隊開展相關工作。近年來，隨著駝源 VHH在各個領域日漸廣泛的應用，尤其是首個VHH藥物 (Cablivi?) 先后被EMA和FDA批準上市之后，同屬單域抗體的VNAR也日益成為抗體領域的研究熱點。與 VHH相比，雖然針對多種靶分子的VNAR被淘選得到，但大多數只是研究了VNAR的特異性、親和力和穩定性等性能，其作為免疫試劑或者藥物的應用性研究則較少。然而 VNAR較傳統抗體所擁有的尺寸小、穩定性強、親和力高、識別隱藏抗原表位以及易于大規模生產等優點，注定其在免疫檢測和治療領域具有廣泛的應用潛力。更為重要的是，目前用于VNAR開發的鯊魚種類不到10種，且未見鰩源VNAR的報道，而現存板鰓亞綱魚類超過千余種(鯊總目約450種，鰩總目約560種)，能夠為VNAR的研究提供極為豐富的材料。有理由相信，隨著研究的深入能夠發現VNAR更多的結構及功能特性，在拓展 VNAR來源的同時有望進一步豐富抗體小型化的理論基礎。