痰瘀同治方調控自噬對心肌缺血區和動脈粥樣硬化斑塊內血管新生不同作用的實驗研究

浙江中醫藥大學附屬第一醫院 杭州 310006

近年來研究發現，血管新生既是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)不穩定斑塊形成的關鍵，又是改善心肌缺血有效的代償途徑[1]。因此，在促進缺血心肌區血管新生和抑制斑塊內血管新生的臨床決策中，存在著內在的矛盾，如何在治療中兼顧這對矛盾是現實存在的難題。目前研究多將兩者孤立開來作為獨立的對象，而將兩者結合進行同步研究，國內外尚未見有報道。痰瘀同治(Tanyu Tongzhi，TYTZ)是目前中醫防治AS和改善心肌缺血的主要治法治則[2-3]。前期工作中已經證實TYTZ方能夠通過抑制大鼠AS斑塊內血管新生，穩定并消退AS斑塊[4]；臨床研究也證實，TYTZ方能夠顯著改善冠心病患者的心肌缺血癥狀[5]，這提示TYTZ方對AS斑塊內和缺血心肌區的血管新生具有雙向調節作用。已知自噬與血管新生關系密切，不同環境下的自噬對血管新生存在不同的作用[6]。因此，本研究擬建立心肌缺血和AS斑塊內血管新生的雙靶點小鼠模型，采用CD31免疫組化染色法評價TYTZ方對心肌缺血區和AS斑塊內血管新生的不同作用，同時觀察自噬標志性蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)Ⅱ/Ⅰ表達水平的變化，分析其中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡雄性C57BL/6J小鼠10只，雄性載脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E gene Knockout，ApoE-/-)小鼠20只，體重均為20～24g，由上海斯萊克公司提供［實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005］，飼養于浙江中醫藥大學實驗動物研究中心屏障環境實驗室［實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2018-0012］。實驗期間，遵循3R原則給予實驗動物人道主義關懷，實驗動物福利倫理審查號［ZSLL-2017-107］。

1.1.2 藥物與試劑 TYTZ方由石菖蒲、全瓜蔞、陳皮、薤白、丹參、水蛭、郁金、茯苓組成，由浙江中醫藥大學制劑中心加工為流浸膏，含生藥2g·mL-1。異丙腎上腺素原藥購自美國Sigma公司 (批號：SLBH1026V)；抗LC3Ⅱ/Ⅰ抗體購自英國Abcam公司(批號：ab48394)；CD31鼠單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司(批號：3528S)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、造模與給藥方法 取ApoE-/-小鼠20只，隨機分為模型對照組和TYTZ組，每組10只，飼喂高脂飼料 (小鼠基礎飼料+15%豬油+1.25%膽固醇)；另取C57BL/6J小鼠10只作為正常對照組，飼喂基礎飼料。飼喂4周后，模型對照組和TYTZ組腹部皮下多點注射100mg/kg異丙腎上腺素針，持續2d；正常對照組皮下注射等量0.9%氯化鈉注射液。造模成功后4周分別開始藥物干預，根據人與小鼠的換算系數決定給藥劑量，按TYTZ方成人劑量換算后的小鼠等效劑量的5倍，TYTZ組給予TYTZ方流浸膏2 145mg/(kg·d)灌胃(蒸餾水稀釋成0.4mL)；模型對照組和正常對照組給予等量蒸餾水灌胃，均連續給藥6周。

1.2.2 標本取材 試驗結束后，過量麻醉處死動物，開胸后小心分離并剪取心臟及整條主動脈。主動脈分段橫切留存，心臟按短軸面留取心肌標本，模型對照組和TYTZ組留取心肌梗死邊緣區組織送檢。各組標本分類編號，一部分放入液氮凍存，另一部分直接冷凍切片。

1.2.3 免疫組化檢測各組心肌和主動脈新生血管密度 對各組標本行內皮細胞特異性標志物CD31染色，內皮細胞的細胞質染為棕黃色即為陽性表達。以Imaging System檢測陽性細胞平均光密度值(mean optical density，MOD)，作為評價新生血管密度的定量指標。

1.2.4 Western blot檢測各組心肌和主動脈的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平 提取病理組織總蛋白后采用Western blot測定各組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達，以凝膠圖象處理系統分析各組目的蛋白條帶與內參照β-actin蛋白條帶的比值，即為LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。所有數據以±s表示，兩組之間均數比較采用Bonferroni檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌組織內新生血管密度比較 免疫組化染色顯示，TYTZ組新生血管表達最豐富。與正常對照組比較，模型對照組及TYTZ組的CD31表達均顯著增加(P＜0.05)；與模型對照組比較，TYTZ組CD31表達明顯增加(P＜0.05)。見圖1、2。

2.2 各組主動脈新生血管密度比較 免疫組化染色顯示，與正常對照組比較，TYTZ組與模型對照組CD31表達均明顯增加(P＜0.05)；而與模型對照組比較，TYTZ組的CD31表達則明顯減低(P＜0.05)。見圖3、4。

圖1 各組心肌組織CD31免疫組化染色(100×)Fig.1 The imaging of myocardial tissue with CD31 immunohistochemical staining in each group(100×)

2.3 各組心肌組織LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較 與正常對照組比較，模型對照組和TYTZ組的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達均明顯增高(P＜0.05)；與模型對照組比較，TYTZ組的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達明顯增高(P＜0.05)。見圖5。

2.4 各組主動脈LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較 與正常對照組比較，模型對照組的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平明顯增高(P＜0.05)；與模型對照組比較，TYTZ組的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)。見圖6。

3 討論

圖2 各組心肌組織新生血管密度比較Fig.2 The density of neovascularization of myocardial tissue in each group

圖3 各組主動脈CD31免疫組化染色(100×)Fig.3 The imaging of aorta with CD31 immunohistochemical staining in each group(100×)

血管新生一方面是改善心肌缺血的有價值的補償手段，另一方面又是導致AS斑塊不穩定的核心因素，血管新生的兩方面作用正逐漸吸引著研究者的興趣。在臨床工作中，當一項干預措施具有拮抗AS斑塊內新生血管的作用時，它也可能具有抑制缺血心肌內微血管形成的不良作用；或者當一項干預措施有利于缺血心肌內微血管形成時，它同樣也可能促進AS斑塊內新生血管形成，從而加重斑塊的不穩定性。所以臨床醫師必須意識到，在臨床上已經被廣泛應用的各種抗心肌缺血的中藥制劑，或是在腫瘤治療中各種抗血管新生的藥物，都存在安全性風險[7]。目前國內外學者多將AS斑塊或缺血心肌內的血管新生孤立開來，分別對其進行研究。而將兩種不同病理環境中的血管新生結合在同一動物模型中，同步研究一種干預措施對兩者的不同作用，國內外尚未見于報道。

圖4 各組主動脈新生血管密度比較Fig.4 The density of neovascularization in aorta in each group

圖5 各組心肌組織LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較Fig.5 Comparison of LC3Ⅱ/Ⅰ protein expression of myocardial tissue in each group

圖6 各組主動脈LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較Fig.6 Comparison of LC3Ⅱ/Ⅰ protein expression of aorta in each group

自噬與血管新生關系密切。體外研究發現，阻斷自噬發生可阻斷血管內皮生長因子介導的人臍靜脈內皮細胞遷移和管型形成，抑制血管新生[8]。反之，通過上調自噬信號分子能夠激活血管內皮細胞表面的內皮生長因子受體2，促進新生血管形成[9]。上述研究表明，激活自噬能夠促進血管新生，而下調自噬水平則抑制血管新生。但在腫瘤內病理性血管新生的研究提示，內皮抑素在上調自噬水平的同時卻能夠抑制腫瘤內病理性血管新生[10]。自噬究竟是抑制還是促進血管新生，與自噬存在的兩面性有關，只有恰當水平的自噬才能發揮其保護作用，這也可以說明自噬對血管生成的影響[11]。國內外關于自噬的研究目前多局限于腫瘤和眼底病理性血管新生領域，而有關自噬是否參與心肌缺血區或AS斑塊內血管新生的研究目前尚未見報道。

TYTZ是中醫防治AS和改善心肌缺血的主要治法治則[2-3]。本課題組在經典古方“瓜萎薤白半夏湯”和“血府逐瘀湯”基礎上，結合長期臨證經驗總結形成了TYTZ方，方劑組成包括全瓜蔞、薤白、石菖蒲、郁金、丹參、水蛭、茯苓、陳皮，具有除濕祛痰、活血化瘀之功效。前期研究證實，TYTZ方具有抑制AS斑塊內血管新生的作用[4]。長期大量的臨床實踐也發現，TYTZ方對冠心病痰瘀互結證具有顯著的臨床療效[5]。這些研究提示TYTZ方對AS斑塊內和缺血心肌區的血管新生可能存在雙向調節作用，但其中作用機制需要進一步研究。

采用皮下多點注射異丙腎上腺素針的方法對ApoE-/-小鼠進行干預，本研究團隊在國內外首次成功建立了心肌缺血和AS斑塊內血管新生的雙靶點小鼠模型[12]。進一步對內皮細胞特異性標志物CD31進行免疫組化染色，檢測了TYTZ方對單一實驗動物體內心肌缺血區和AS斑塊內新生血管密度的影響。結果發現，在心肌缺血區，TYTZ組CD31表達明顯高于模型對照組；而在主動脈斑塊中，TYTZ組CD31表達明顯低于模型對照組，證實了TYTZ方在抑制AS斑塊內血管新生的同時能夠促進心肌缺血區的血管新生。

LC3Ⅱ/Ⅰ是最早發現的自噬標志性蛋白，LC3Ⅱ/Ⅰ的表達量與自噬小體數量正相關，是反映細胞自噬活性的關鍵指標，也是目前最常用的自噬水平檢測標志物[13]。本研究結果顯示，模型對照組心肌組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平顯著高于正常對照組，而TYTZ組的LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平又顯著高于模型對照組，這提示TYTZ方通過進一步上調自噬蛋白表達，進而促進心肌缺血區內血管新生；在主動脈中，模型對照組的LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平顯著高于正常對照組，TYTZ組的LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平則低于模型對照組，這提示激活自噬也能夠促進AS斑塊內血管新生，而TYTZ方通過下調斑塊內自噬蛋白表達水平，抑制斑塊內血管新生。而且本研究提示，自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平與血管新生程度相應。

上述研究結果表明，TYTZ方對心肌缺血區和AS斑塊內的自噬水平存在雙向調節作用，這可能是該方對血管新生雙向調節作用的重要機制。