miR-200b-Notch信號通路對誘導性多能干細胞向神經干細胞分化的調控作用

廖偉 蔡崇明 陳金明

摘要：目的? 探究miR-200b靶向Hes1調控Notch信號通路對iPS細胞向神經干細胞分化的影響。方法? 采用結合維甲酸和無血清培養基誘導法誘導iPS細胞向神經干細胞分化，分別在誘導分化的第0、4、8、15d采用實時熒光定量PCR檢測miR-200b水平，Westernblot法檢測Hes家族bHLH轉錄因子1（Hes1）、Notch1蛋白水平，應用生物信息學軟件預測并通過熒光素酶報告實驗驗證miR-200b與Hes1之間的靶向結合作用。結果? 在iPS細胞向神經干細胞分化誘導分化的第0、4、8、15d，miR-200b水平逐漸升高，Hes1、Notch1蛋白水平逐漸降低，差異有統計學意義（P<0.05）;生物信息學分析顯示，Hes1為miR-200b的靶基因，過表達miR-200b可升高神經干細胞分化，上調Hes1水平調控Notch信號通路相關分子。結論? miR-200b可促進iPS細胞向神經干細胞分化，其機制可能與其靶向上調Hes1表達，進而促進Notch信號通路的激活有關。

關鍵詞：誘導性多能干細胞;神經干細胞;miR-200b-Notch;信號通路

Abstract：Objective? To explore the effect of miR-200b targeting Hes1 to regulate the Notch signaling pathway on the differentiation of iPS cells into neural stem cells.Methods? Combining retinoic acid and serum-free medium was used to induce iPS cells to differentiate into neural stem cells. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the level of miR-200b on the 0th， 4th， 8th， and 15th d of the induced differentiation， and the Hes family was detected by Western blot method. The bHLH transcription factor 1 （Hes1） and Notch1 protein levels were predicted by bioinformatics software and the targeted binding effect between miR-200b and Hes1 was verified through the luciferase report experiment.Results? On the 0th， 4th， 8th， and 15th d after the differentiation of iPS cells into neural stem cells， the level of miR-200b gradually increased， and the levels of Hes1 and Notch1 protein gradually decreased，the difference was statistically significant （P<0.05）; Bioinformatics analysis showed that Hes1 is the target gene of miR-200b. Overexpression of miR-200b could increase the differentiation of neural stem cells and up-regulate Hes1 levels to regulate Notch signaling pathway related molecules.Conclusion? miR-200b could promote the differentiation of iPS cells into neural stem cells， and its mechanism might be related to its targeted up-regulation of Hes1 expression， which in turn promoted the activation of Notch signaling pathway.

Key words：Induced pluripotent stem cells;Neural stem cells;miR-200b-Notch;Signaling pathway

誘導性多能干細胞（iPS）是一類與胚胎干細胞（ES）具有相似全能分化特性的重編程多能干細胞，目前已有研究證實[1]，iPS可定向分化為神經干細胞、神經前體細胞等，而且通過iPS細胞體外定向誘導分化的細胞在其相應疾病治療中可獲得較為理想的效果，但是關于iPS誘導分化的具體調節機制目前尚未完全確切。近年，越來越多研究發現[2，3]miR-200b和Notch信號在胚胎干細胞的增殖與分化發揮著重要的調控作用，然而miR-200b和Notch信號是否能夠調控iPS細胞向神經細胞定向分化的機制并不清楚。為此，本研究擬通過重組慢病毒技術、qRT-PCR等技術觀察iPS細胞定分化為神經干細胞過程中mir-200b、Notch通路等相關信號分子的表達變化及作用，旨在闡明iPS細胞神經定向分化的具體調控途徑，報道如下。

1材料與方法

1.1實驗材料? iPS-S細胞系（上海亞遊生物科技有限公司），TRIzon總RNA提取試劑（上海聯邁生物），Fast Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒（上海一基生物），Ultra SYBR Mixture試劑盒（上海研謹生物），兔抗人 Notch1 單克隆抗體、兔抗人Hes1多克隆抗體（博士德生物公司）。

1.2方法

1.2.1誘導iPS細胞向神經干細胞分化? 把iPS細胞接種在含有絲裂霉素C的鼠胚胎成纖維細胞的飼養層，集落長滿后加入膠原酶消化，先在無血清培養基懸浮培養4 d，隨后置于含有維甲酸的神經干細胞培養基誘導培養4 d，再在神經干培養基中懸浮培養7 d，最后接種到經層粘連蛋白包被的24孔板中培養，分別收集誘導分化的第0、4、8、15天的細胞備用。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測? ①總RNA提?。喝∵m量細胞樣本，加入1 mlTRIzon液的比例加入適量TRIzon液混勻，按照試劑盒說明書進行總RNA提取。②cDNA合成：應用RT-PCR法進行檢測，取5 μl RNA為逆轉錄模板，以U6 RNA為內參基因，嚴格按照Fast Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒進行操作，加入miRNA莖環引物充分震蕩混勻，并予以短暫離心處理以使溶液集中于EP管底。然后將其置于42 ℃環境中孵育30 min，置于85 ℃中孵育3 min。最后對其進行短暫離心處理，并放在冰上冷卻獲得逆轉錄產物cDNA。③實時定量PCR反應：嚴格按照Ultra SYBR Mixture試劑盒說明書進行熒光實時定量PCR實驗，設置反應條件：預變性95 ℃ 10 min，變性95℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，40個循環，進行擴增反應，計算miR-200b表達量。

1.2.3 Westernblot檢測? 用RIPA裂解誘導分化的第0、4、8、15天樣本細胞提取的總蛋白，先采用紫外分光光度計檢測蛋白的濃度，利用SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳將蛋白轉移至PVDF膜，進行封閉處理，添加兔抗人 Notch1 單克隆抗體、兔抗人Hes1多克隆抗體，4 ℃孵育后進行3次TBST洗膜，添加二抗在室溫下孵育1 h，隨后加入ECL化學發光試劑盒檢測雜交信號，曝光后掃描膠片，使用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以β-actin蛋白作為內參，計算出目標蛋白條帶的灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值，即為Hes1、Notch1蛋白相對表達量。

1.2.4熒光素酶報告基因實驗檢測? 應用TargetScan miRNA靶基因預測miR-200b在Hes1上的結合位點，構建Hes1的3-非編碼區、Notch1的3-非編碼區報告基因質粒，以此轉染至miR-200b穩定表達，根據Dual-Luciferase（Promega）雙熒光素酶報告系統試劑盒說明書檢測熒光素酶相對活性。

1.3統計學方法? 應用統計學SPSS23.0軟件對實驗數據進行分析，計數資料采用（%）表示，行？字2檢驗;計量資料以（x±s）表示，行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

在iPS細胞向神經干細胞分化誘導分化的第0、4、8、15天，miR-200b水平逐漸升高，Hes1蛋白、Notch1水平逐漸降低，不同時間點其表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。生物信息學分析顯示，Hes1為miR-200b的靶基因，過表達miR-200b可升高神經干細胞分化，上調Hes1水平調控Notch信號通路相關分子，見圖2、圖3。

3討論

作為一種神經前體細胞，神經干細胞具有自我更新并分化為神經元、星形膠質細胞等大腦各類細胞的功能。從理論上來講，神經干細胞有多向分化的潛能，因誘導多能干細胞（iPS細胞）可分化為多種能夠用于中樞神經系統疑難疾病的細胞替代治療，具有廣大應用前景[4]。然而，在實際臨床應用中，神經干細胞的替代治療仍處于非常早期基礎研究階段，而且受免疫排斥、倫理等問題影響，尚不能將iPS細胞誘導為任意細胞，通常是誘導后的細胞中包含多種細胞類型。因此，探究iPS細胞誘導分化的調控機制對于其臨床應用有重要意義。

miRNA是由21～25個小分子核苷酸所組成的非編碼RNA，廣泛分布在哺乳動物基因組，其能夠通過靶向作用于蛋白編碼基因，阻止蛋白質的轉錄與翻譯，進而參與細胞發育、分化增殖、凋亡等多項生理過程[5]。多項研究顯示[6]，多種miRNA可調控神經干細胞調節因子表達水平，在干細胞的調控、自我更新功能發揮著重要的作用。miR-200b為一種新型miRNA，有研究報道[7]，miR-200b在腦腫瘤組織中的表達水平較正常腦組織顯著升高。筆者在前期課題研究中發現在iPS細胞向NSC定向分化的過程中，miR-200b表達量明顯升高，我們推測miR-200b可通過其靶基因Notch1介導Notch信號通路調控了iPS細向NSC的定向分化過程。蔣明等[8]的研究也發現，誘導分化神經干細胞過程中miR-200b有可能是Notch信號通路的重要調控因子。

bHLH基因對于神經干細胞的增殖、分化、自我更新能力有重要的作用。Hes家族中的7個成員均為bHLH基因，其中Hes1、Hes5為Notch基因的靶基因，其表達水平極易受Notch因子的增殖活化而上調。動物實驗研究證實[9]，Notch通路在誘導iPS細胞向神經干細胞分化調控中起著重要作用，也是維持神經干細胞自我更新的關鍵。房裕鈔等[10]的研究提出，在腦缺血再灌注損傷機制中miR-200b可通過Notch信號通路下調Hes1表達。秦杰等[11]研究報道Notch1和Hesl激活在調控神經干細胞中的作用，當敲除Hes1、Notch1基因時，不成熟神經元分化數量會顯著增加，致使大范圍神經發育缺陷，提示在神經正常發育過程中，Hes1、Notch1對維持神經干細胞的特性是必需的。本研究結果顯示，在iPS細胞向神經干細胞分化誘導分化的第0、4、8、15天，miR-200b水平逐漸升高，Hes1、Notch1蛋白水平逐漸降低，且經生物信息學分析證實Hes1為miR-200b的靶基因，可知miR-200b在體外促進神經干細胞分化是通過抑制Notch信號通路來實現的。目前已有大量研究發現[12]，Notch信號通路在神經發育過程中發揮著重要的作用。在神經發育過程中，表達于中樞神經系統的Notch配體、受體均與神經前體細胞的增殖、維持及分化等過程密切相關[13]。有研究指出[14]，激活Notch信號通路有利于促進神經干細胞增殖，而抑制Notch信號通路可對神經干細胞分化發揮促進作用。正鑒于此，筆者推敲Notch通路有可能參與miR-200b對神經干細胞神經分化的調節過程，miR-200b過表達可使神經干細胞Notch信號通路下游靶基因Hes1表達水平下降，進而抑制Notch信號通路，促進神經干細胞分化。

綜上所述，miR-200b可促進iPS細胞向神經干細胞分化，其機制可能與其靶向上調Hes1表達，進而促進Notch信號通路的激活有關。

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收稿日期：2020-05-09;修回日期：2020-06-12

編輯/成森