純鎂載聚乳酸-乙醇酸膜層的體內骨結合與降解行為

鄭凱寧， 肖 月， 李慕勤， 張二林， 姚 濰， 初明慧

（1.黑龍江佳木斯大學附屬口腔醫院修復科，2.佳木斯大學黑龍江省高校生物醫學材料重點研究實驗室，3.佳木斯大學生命科學實驗中心，黑龍江 佳木斯154007；4.東北大學材料科學與工程學院材料各向異性與織構教育部重點實驗室，遼寧 沈陽110004）

目前，臨床上多用高分子聚合材料和鈦進行 植入和固定。鈦的彈性模量過高，與人體骨組織不匹配，易產生應力遮擋效應，影響骨骼的生長和重構[1]；而且，由于鈦在人體內不能降解，需進行二次手術才能被取出，會對患者造成二次損傷[2]。高分子聚合材料因其較差的機械性能，現多用作骨填充材料。鎂與人骨彈性模量相近，且在人體內可自然降解。通過對腎小管再吸收量的控制，可將血鎂濃度控制在一定范圍內。但鎂性質活潑，在生理環境中會快速降解，不能實現與骨的完全愈合[3-5]。因此，如何調控鎂降解速率，且促進新骨形成已成為當下醫學研究的熱點。

微弧氧化（MAO）技術是近年來比較熱門的在有色金屬表面原位生長氧化物陶瓷層的一項技術[6]。該技術操作簡單，能使純鎂具有更好的耐蝕性、耐磨性及更高的顯微硬度,是一項常見的醫用金屬植入體表面生物改性技術[7]。以往實驗中多以純鎂微弧氧化來控制鎂的降解速率，涂層的骨結合效果有待于提高。聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）由2種單體乳酸和羥基乙酸隨機聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機化合物。它具有良好的生物相容性、合適的機械強度、可控的生物降解性[8]，被廣泛應用于制藥、醫用工程材料領域。PLGA可抑制巨噬細胞的浸潤,減少炎癥反應,這些優點有利于骨再生修復；還可以通過調整單體比，進而改變PLGA的降解時間[9-10]。

針對醫用鎂合金在體內降解速率過快，降解產物為堿性氧化物，微區堿性過高不利于成骨細胞生長的特點，利用PLGA可將體內降解為酸性。二者結合既可調控鎂基體體內降解產物的pH，又能控制鎂基體的降解速率，形成互補；加之PLGA具有抗炎及促進骨組織修復的特性，能加快鎂基體周圍骨組織愈合和骨生長，但該方面的研究鮮有報道。因此，在醫用純鎂表面做酸堿糙化處理及強堿活化處理，使純鎂表面羥基化，負載PLGA作為實驗組，以目前研究較多的純鎂微弧氧化層為對照組，分析比較二者體內促進骨生長和控制降解速率的差異，期望為可降解醫用純鎂的臨床應用提供一條新途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

佳木斯大學動物實驗中心提供的已適應動物實驗房生長環境的24只2～3月齡的家兔，體質量為2.0～2.5 kg。

1.2 實驗用品、器材和設備

純鎂螺釘（下文簡稱為鎂釘）共計48枚（長度為7.5 mm，直徑為2.5 mm），純鎂接骨板（下文簡稱為鎂板）共計16枚（長度為14 mm，寬度為6 mm，厚度為1.5 mm）（東北大學材料科學與工程學院）；PLGA（PLGA中丙交酯與乙交酯比例相同，濟南岱罡生物工程有限公司）；陸眠寧，2%利多卡因，抗生素(青霉素、慶大霉素)，地塞米松，生物清潔工作臺（佳木斯大學）；牙科微動力低速手機（佳木斯大學醫學實驗室）；MAO-Ⅱ微型氧化電源（哈爾濱工業大學先進表面技術研究中心）；環氧乙烷滅菌機（佳木斯大學附屬第一醫院）；CBCT（美國Kodak公司）；Leica硬組織切片機（德國徠卡公司）；FV1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司）。

1.3 試劑制備及分組

1.3.1 PLGA膜層制備 將鎂釘放入酒精中消毒，用質量濃度為80 g/L的碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液對其進行堿處理，時間為10 s，再用100 g/L的磷酸（H3PO4）溶液對其進行酸處理，時間為15 s；蒸餾水清洗后，放入120 g/L的氫氧化鈉（NaOH）溶液中以60℃恒溫水浴1 h，對螺釘進行羥基活化，再將螺釘放入1% PLGA（1 g PLGA溶于100 mL二氯甲烷）溶液中浸泡提拉1 min，重復浸泡提拉3次后，晾干備用。

1.3.2 MAO膜層制備 將鎂釘酸堿處理后，放入硅酸鹽電解液中，在電壓300 V，脈寬50μs，頻率500 Hz，超聲波頻率60 kHz，超聲功率60 W的條件下進行微弧氧化，計時7 min；再將電壓調至200 V，計時3 min。

1.3.3 動物分組 將實驗動物分為2組，純鎂微弧氧化膜層為對照組（MAO組），純鎂載PLGA膜層為實驗組（PLGA組）。將2組表面鍍膜的鎂釘和鎂板進行環氧乙烷滅菌處理后備用。分別于2、4、8、12周時對2組家兔進行相應處理，每個時間點設3只家兔（1~3號），共24只家兔。在1號家兔體內僅植入2個鎂釘；將2號和3號家兔分別制作骨折模型，并植入2個鎂釘和1個鎂板。單籠喂養。

1.3.4 動物手術 將手術家兔逐個稱重并記錄，按0.2 mL/kg的劑量將陸眠寧肌肉注射于家兔腿部，進行全身麻醉。將家兔仰臥固定在無菌手術臺上，頭偏向一側，將手術區域剃毛并用碘伏進行消毒，注射2%利多卡因進行局部麻醉。切開皮膚，做大約2 cm的長切口，用止血鉗鈍性分離皮下筋膜層，游離皮下肌肉，使用大裂鉆定位后，在距下頜骨下緣8~10 mm處植入鎂釘，間距為3 mm。用超薄金剛砂片對植入鎂釘和鎂板的家兔做不穿通口腔的線性骨缺損，在骨折線兩端制備2個植入窩洞，植入鎂釘并固定鎂板，制備骨折模型。制備過程中用0.9%氯化鈉溶液降溫，在骨面上放置少量青霉素，止血，逐層縫合。

1.3.5 術后護理 為預防感染，術后對家兔注射0.1 mg/kg的地塞米松和0.5 mg/kg的鹽酸慶大霉素，每日1次，連續3 d。實驗過程中動物無意外死亡，術后每周測量1次體質量。所有家兔愈后良好，未發生感染、過敏、局部產氣等情況；精神狀態良好，飲食、飲水、大小便均正常。

1.3.6 藥物注射 注射熒光素以檢測骨生長情況。2周組的家兔在第3天時，注射茜素紅，4 d后注射鈣黃綠素；4周組在第7天時注射茜素紅，7 d后注射鈣黃綠素；8周組分別于第14、21天時注射茜素紅，14 d后注射鈣黃綠素。茜素紅的注射劑量為18 mg/kg，注射質量濃度為10 mg/mL，溶劑為0.9%氯化鈉溶液。鈣黃綠素注射劑量為6 mg/kg，注射質量濃度為10 mg/mL，溶劑為磷酸氫二鈉。注射部位均為家兔術側頸部皮下。

1.4 標本取材及檢測

在耳緣靜脈處注射空氣處死家兔，截取家兔術側下頜骨，固定于4%中性甲醛中。CBCT檢測后，切割成大小為15 mm×12 mm×10 mm的小塊，進行梯層脫水、浸潤與包埋處理。包埋完成后用硬組織切片機將標本骨塊切成厚度為5 mm左右的組織切片，將其手動研磨至厚度為70μm左右，用于掃描電鏡、能譜分析、激光共聚焦等檢測。

2 結果

2.1 CBCT檢測

將截取骨塊的下頜升支側朝下，垂直懸掛于水溶液中，并將其放置于CBCT檢測臺上，調節檢測臺高度確定每組觀測位置。2、4、8和12周時，MAO組和PLGA組鎂釘的CBCT矢狀面和橫斷面影像見圖1。2周時，PLGA組純鎂螺釘與骨組織間存在明顯的低密度影像；4周和8周時，低密度影像區逐漸被高密度的骨組織充填；12周時，鎂釘與骨組織間低密度影像區明顯減小。2周和4周時，MAO組釘周低密度影像區較PLGA組略大；8周和12周時，釘周低密度影像區明顯增大。隨時間的延長，2組的鎂釘直徑均不斷減小，4周時MAO組鎂釘直徑為2.2 mm，PLGA組鎂釘直徑為2.4 mm；12周時MAO組鎂釘直徑為1.9 mm，PLGA組鎂釘直徑為2.2 mm。在同一時間內，PLGA組較MAO組鎂釘周圍骨密度高，低密度透射影像范圍小，鎂釘直徑大。說明PLGA組骨結合更好，耐蝕性更佳。

2.2 Micro-CT檢測

2組鎂基體植入后4和8周的Micro-CT圖像見圖2。隨時間增長，鎂釘的螺紋逐漸模糊，鎂釘和鎂板降解逐漸增多。表1為4、8周時，2組鎂釘植入后骨小梁的檢測數據。由表中可見，PLGA組骨小梁數量明顯多于MAO組，且骨小梁間距小，說明純鎂載PLGA膜層具有更高的成骨活性。圖3為各時間段2組鎂基體剩余體積柱狀圖。由圖中可見，隨時間增長，2組鎂基體剩余體積均逐漸減小，但PLGA組剩余體積較MAO組大，且隨時間增長2組鎂基體剩余體積差值逐漸增大。計算4、8和12周時2組鎂基體降解率，MAO組為11.44%、19.58%、36.73%，PLGA組為6.31%、11.63%、16.09%。根據回歸方程可計算出MAO組完全降解需8個月，PLGA組完全降解需17個月。該結果說明PLGA涂層有效降低了鎂基體的降解速率。

圖1 2、4、8和12周時MAO組和PLGA組鎂釘的CBCT影像Figure 1 CBCT images showing magnesium implants in MAO and PLGA groups of rabbits at 2,4,8 and 12 weeks

圖2 4周和8周時鎂釘和鎂板的Micro-CT影像Figure 2 Micro-CT images of magnesium implants and magnesium plates at 4 and 8 weeks

圖3植入前，術后4、8和12周時2組鎂基體的剩余體積Figure 3 Residual volume of magnesium matrix before implantation and 4,8 and 12 weeks after implantation

2.3 激光共聚焦觀察

圖4是2、4和8周時，2組鎂基體的激光共聚焦影像。2周時，MAO組熒光強度微弱，而PLGA組螺釘周圍有明顯的熒光標記；4周時，MAO組螺釘周圍僅有一層稀薄熒光標記，而PLGA組鈣黃綠素與茜素紅熒光標記在近螺釘處高度重疊，說明4周時PLGA組螺釘周圍有大量鈣鹽沉積和新骨形成；8周時，MAO組熒光強度明顯增強，熒光標記范圍擴大，PLGA組部分熒光標記已遠離螺釘周圍，近螺釘處熒光強度減弱。相同時間點時，MAO組熒光強度較弱，熒光條帶狹窄，PLGA組熒光強度較強，條帶較粗。以上結果說明，相較于MAO組，PLGA組新骨生成更為活躍。

圖4 2、4、8周時MAO組和PLGA組鎂釘激光共聚焦影像Figure 4 Confocal laser images of magnesium implants in MAO and PLGA groups at 2,4 and 8 weeks

2.4 植體與骨界面掃描電鏡形貌和元素分析

圖5為2組鎂基體植入后4周和8周時的掃描電鏡形貌和元素分析。4周時，MAO組涂層已幾乎完全消失，附著骨組織稀疏；PLGA組鎂釘表面存在清晰且連續一致的涂層，且有薄層新生骨緊密地結合在鎂釘螺紋處。8周時，MAO組鎂釘嚴重降解，鎂釘螺紋結構消失，新生骨與鎂釘間存在明顯間隙；PLGA組鎂釘螺紋結構仍存在，大量新生骨組織成條帶狀，且與鎂釘緊密相連。從界面元素分布中可以看出，植入界面中出現的元素有Mg、Ca、P，其中Mg為主要元素，并從鎂基體向骨組織方向擴散。MAO組4和8周時，骨組織處均有散在Mg元素；PLGA組僅在8周時，骨組織處可見少量Mg元素。界面處可見大量Ca、P元素，MAO組4周時Ca、P元素稀薄，8周時Ca、P元素增加，但與鎂釘存在間隙；PLGA組4周時有少量Ca、P元素沉積在涂層表面，8周時，Ca、P元素富集成帶并與鎂釘表面緊密貼合，鎂釘降解部分被Ca、P元素充填。以上結果說明PLGA組骨結合更好，鎂釘降解少。

表1 4、8周時2組鎂釘的骨小梁數據Table 1 The magnesium implants trabecular bone data of two groups at 4 and 8 weeks

圖5 MAO組和PLGA組4、8周時鎂釘掃描電鏡形貌及元素分析Figure 5 Morphology characterization and element analysis by SEM of magnesium implants in MAO and PLGA groups at 4 and 8 weeks

3 討論

在醫用金屬中，鎂及鎂合金具有與人骨最為相近的彈性模量，并能自行降解。鎂具有良好的骨誘導性，局部富含Mg2+的環境可以刺激骨髓干細胞分化為成骨細胞，并促進成骨細胞黏附、生長和增殖，從而加快骨愈合速度[11]。但鎂元素化學性質活躍，其被植入后常未能達到良好的生理性骨愈合，就已喪失負載能力而早早降解。研究表明，鎂基體快速降解會產生大量氫氣和堿性氧化物，使局部pH上升，導致骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）過量分泌，進而激活破骨細胞，發生溶骨[12]。利用微弧氧化技術可在鎂基體表面形成一層致密的氧化膜，該技術是目前常用的一種鎂基體表面改性技術。PLGA由乳酸和羥基乙酸2種單體復合共聚而成，具有良好的親水性和可降解性，PLGA降解產生的乳酸和乙醇酸能中和局部pH，促進骨生長。

本研究中，CBCT結果顯示，PLGA組較MAO組骨密度大，低密度影像小，說明純鎂載PLGA膜層與骨生長速度更匹配。4、12周時，PLGA組鎂釘直徑均＞MAO組，證明PLGA膜層耐蝕性更佳；8、12周時，MAO組鎂釘周圍低密度影像明顯增大，可能是由于微弧氧化涂層降解后，鎂基體快速降解產氣，阻礙了骨組織的愈合。Micro-CT結果顯示，4、8周時，PLGA組較MAO組骨小梁數量多，骨小梁間距小，證明PLGA膜層較微弧氧化膜層周圍骨組織形成更多。2組8周時較4周時骨小梁數量少，骨小梁間距大，說明8周時鎂釘周圍的骨組織正在向成熟骨轉變。一般初期骨痂愈合時間為2個月，8周時PLGA組鎂基體形態基本完整，可認為純鎂載PLGA膜層可在下頜骨內承擔2個月的固定作用。根據回歸方程估算，MAO組鎂釘完全降解需8個月，PLGA組完全降解需17個月。結果證明，相比微弧氧化涂層，PLGA涂層更有效地降低了鎂基體的降解速率。黃晶晶等[13]發現，在鎂基體表面浸涂PLGA可有效提高其在體外模擬環境中的耐蝕性，結果與本文一致。本研究中的激光共聚焦結果顯示，隨時間增長，2組熒光標記范圍逐漸變大，熒光強度變強；但PLGA組熒光強度明顯強于MAO組，熒光條帶也更粗，結果證明PLGA膜層具有更強的促新骨形成能力。8周時，PLGA組部分熒光標記遠離螺釘周圍，螺釘周圍熒光強度減弱，說明PLGA組8周時螺釘周圍已形成成熟骨組織。這可能是由于鎂基體與PLGA膜層同時降解，鎂基體降解產生的堿性氧化物被PLGA降解產生的酸性產物中和，同時降解的鎂元素促進了骨組織修復。陳偉等[14]用油浴法和萃取法制備Mg-PLGA復合材料，發現降解過程中其pH基本正常，佐證了此觀點。掃描電鏡和元素分析結果顯示，PLGA膜層可促進新骨形成并延緩鎂基體降解，同時與骨組織緊密貼合，提高了骨結合強度，促進Ca、P元素沉積。

目前國內外的鎂基體材料多以微弧氧化法、離子注入等表面改性技術提高鎂基體的耐蝕性，但對鎂基體降解時pH的調控鮮有研究[15]。本研究通過純鎂表面羥基活化載PLGA，對鎂基體降解時的pH進行調控，并利用PLGA可控的降解速率控制鎂基體的降解速率，使之與骨的生長速度相匹配。

綜上所述，純鎂羥基活化載PLGA膜層明顯降低了鎂基體的降解速率，提高了鎂基體的耐蝕性，并且誘導新骨形成，促進骨結合，為鎂的臨床應用提供了一條新途徑。但有關此膜層的制備方法還需進一步研究。