載他克莫司可注射溫敏型水凝膠促牙周組織再生的研究

陳 希， 任春霞， 劉莉莉， 陳雨蒙，鄭夢丹， 崔家森， 盧金金， 孫宏晨,

（1.吉林大學口腔醫學院病理科，吉林 長春130021；2.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林長春130021；3.中國醫科大學附屬口腔醫院口腔病理科，遼寧 沈陽110001；4.吉林大學口腔醫院牙周科，吉林 長春130021；5.吉林大學口腔醫院兒童口腔科，吉林 長春130021）

牙周炎是一種由微生物和宿主免疫系統之間相互作用引起的慢性炎癥性疾病。該疾病不僅能破壞牙齒的支持結構（牙齦、牙周膜及牙槽骨），導致牙齒松動脫落，同時也與全身系統性疾病關系密切[1-2]?，F有的牙周治療手段，如牙周基礎治療、翻瓣術及自體骨移植術等僅能減小牙周袋和根分叉損害的探診深度，無法實現牙周組織的完全恢復[3-4]。因此，臨床上亟須開發具有促進牙周組織再生作用的新型牙周炎治療制劑。

FK506也稱他克莫司（tacrolimus），是從鏈霉菌屬中提取出來的一種抗生素，也是臨床常用的強效免疫抑制劑[5]。目前的多項研究發現，FK506具有抗炎，促進骨形成和骨缺損修復的作用[6-7]。由于抗炎與促進骨形成是促進牙周組織完全恢復的關鍵靶點[8]。因此，這些研究提示FK506在牙周炎的治療中具有良好的應用前景。

選擇合適的載體是提高藥物效率的關鍵[9]。水凝膠作為應用較廣泛的藥物載體，可被制成可注射劑型?？勺⑸湫退z具有臨床操作簡便，注射所需創口小，液體狀態下具有流動性以充填于不規則組織缺損腔隙等諸多優點[10-12]。此外，該載體具有藥物緩釋性能，能夠實現長期、持續、少量給藥，使所包載的藥物穩定、持續、高效地在局部釋放，并發揮作用[13]。

本研究擬制備載FK506可注射溫敏型水凝膠，研究其物理性能。采用大鼠牙周炎模型，研究其促牙周組織再生的功能；并通過體外細胞研究，探討該制劑的生物安全性，以期為FK506在牙周炎治療的臨床應用中提供參考。

1 材料和方法

1.1 載FK506水凝膠的制備及形態觀察

殼聚糖（CS）、β-甘油磷酸鈉、明膠、FK506均購自美國Sigma-Aldrich公司。取5 mg FK506粉劑，溶于0.1 mL的無菌二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）中，配置成質量濃度為50 mg/mL的FK506儲存液，用無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）將FK506儲存液稀釋至3.27μg/mL，備用。質量分數為2%CS、56%β-甘油磷酸鈉溶液（含20μg/mL的FK506）及0.5%明膠水溶液按照不同體積比（10∶2∶0.25）磁力攪拌并振蕩混勻，調節pH至7.0。密封后置于37℃水浴恒溫箱中孵育，待其形成固態凝膠后冷凍干燥，掃描電鏡（JEOL公司，日本）下觀察其顯微結構。

1.2 大鼠牙周炎模型建立

將50只雄性Wistar大鼠（體質量180~220 g，6~7周齡，清潔級，購自吉林大學生命科學院實驗動物中心）隨機分為5組，每組10只。實驗分組：空白組（正常Wistar大鼠，未建模）、牙周炎組（放置結扎絲）、牙周炎+水凝膠組（放置結扎絲，同期注射水凝膠）、牙周炎+載FK506水凝膠組（放置結扎絲，同期注射載FK506水凝膠，FK506質量濃度：3.27μg/mL）及牙周炎+FK506組（放置結扎絲，同期注射FK506溶液，FK506質量濃度：3.27μg/mL）。Wistar大鼠經10%水合氯醛（20 mg/kg）麻醉；置結扎絲于大鼠雙側上頜第一磨牙與第二磨牙之間，并將結扎絲環繞上頜第一磨牙牙頸部1圈[14]；同期分別注射25μL相應溶液至結扎絲所在牙位牙槽嵴頂的黏骨膜下。常規動物復蘇及飼養。藥物注射頻率為每3天1次，持續2周。

1.3 Micro-CT圖像分析

全麻狀態下，用4%多聚甲醛心臟灌流固定后，取大鼠雙側上頜骨置于4%多聚甲醛溶液中繼續固定24 h。采用Micro-CT進行掃描（電流：114 mA；電壓：70 kV；曝光時間：0.3 s）。選定感興趣區域（region of interest，ROI），測量上頜第一磨牙和第二磨牙間的牙槽骨區域。測量的相應參數：骨礦物質密度（bone mineral density,BMD）；組織礦物質密度（tissue mineral density,TMD）；骨體積分數 （bone volume/total volume,BV/TV）；骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）；骨小梁數目（trabecular number,Tb.N）；骨小梁分離度（trabecular separation,Tb.Sp）。

1.4 形態學分析

將上頜骨標本置于10%的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片（切片厚度為3.0μm）。常規HE染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察炎性細胞的分布和牙周組織的再生效果。

1.5 免疫組織化學分析

取3.0μm石蠟切片，常規脫蠟至水，于枸櫞酸鈉緩沖液中進行微波抗原修復；PBS沖洗3次，每次5 min，3%過氧化氫溶液滅活內源性過氧化物酶10 min；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加山羊血清置室溫封閉1 h，滴加兔抗大鼠MMP-9（1∶500）、兔抗大鼠COX-2（1∶500）抗體，4℃孵育過夜；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標記的二抗置室溫孵育10 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素生物素溶液置室溫孵育20 min；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine,DAB）顯色，蘇木精復染，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 MTT法檢測載FK506水凝膠對細胞增殖活性的影響

Wistar大鼠處死后取股骨，采用全骨骨髓法提取、分離并培養大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）[15]。體外細胞實驗分組：空白組、水凝膠組、載FK506水凝膠組及FK506組。采用Transwell共培養系統（0.4μm孔徑，6孔板，美國Costar公司），在小室內注入水凝膠，置于37℃、5% CO2的孵箱內，待其凝固。將消化收集的第3代BMSCs以2×105個/孔的密度接種于Transwell下室中。共培養48 h后，移走上層小室，加入MTT（200μL/孔）至下室，終質量濃度為5 mg/mL。37℃孵育4 h，棄培養基，每孔加入1.5 mL二甲基亞砜（DMSO）混勻，酶標儀（深圳雷杜生命科學技術有限公司）測490 nm波長處吸光度值。

1.7 統計學分析

采用SPSS 10.00軟件進行統計學處理。各實驗組和空白組樣本均數比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 水凝膠的形貌表征觀察

采用Nano measure軟件分析得出，以CS、β-甘油磷酸鈉、明膠為原料的可注射溫敏型水凝膠的孔徑均等，平均直徑為40～80μm。該水凝膠有利于細胞爬入、營養物質吸收和細胞代謝廢物排出。

2.2 載FK506水凝膠促牙周組織再生作用

本研究采用Micro-CT檢測大鼠上頜骨磨牙區牙槽骨的修復情況（圖1）。釉牙骨質界與牙槽嵴頂（cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC）之間的垂直距離增加表示牙槽骨破壞。實驗2周后，牙周炎組CEJ-ABC平均距離比空白組大50%，且差異有統計學意義（P＜0.01）。該結果表明我們成功地建立了牙周炎模型；牙周炎+水凝膠組和牙周炎+FK506組的CEJ-ABC平均距離仍大于空白組，但與牙周炎組相比，CEJ-ABC平均距離已下降；經載FK506水凝膠處理2周后，CEJ-ABC平均距離與空白組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖2。

Micro-CT定量分析顯示，與空白組相比，我們觀察到牙周炎組BMD（P＜0.001）、TMD明顯減?。≒＜0.01），BV/TV明顯降低（P＜0.01），Tb.Th也有所降低（P＜0.05），Tb.N無明顯變化，Tb.Sp增加（P＜0.01）。以上數據表明我們成功建立了大鼠牙周炎模型，結扎絲的機械刺激及炎癥因素等導致ROI骨組織明顯破壞。與牙周炎組相比，牙周炎+水凝膠組及牙周炎+FK506組的TMD和BV/TV顯著增加（P＜0.05），其中牙周炎+水凝膠組Tb.Sp有所降低，但差異不明顯。這表明單獨應用水凝膠或者FK506可以在一定程度上緩解牙槽骨破壞的嚴重程度。此外，水凝膠與FK506聯合應用后（牙周炎+載FK506水凝膠組），其BMD比牙周炎組明顯增大（P＜0.05），TMD增 加33.3%（P＜0.05），BV/TV增 加240%（P＜0.05），Tb.Sp減少55.9%（P＜0.001），Tb.N增加81%（P＜0.001），Tb.Th無明顯變化。這些結果表明，負載FK506的水凝膠可以有效地協同抑制炎癥并促進牙周組織再生。詳見圖3。

圖1 Micro-CT掃描結果顯示牙槽骨再生情況Figure 1 Micro-CT images showing regeneration of the alveolar bone

圖2各組CEJ至ABC的距離比較Figure 2 Quantitative comparison on the distance from CEJ to ABC

2.3 組織學分析結果

應用HE染色法評估炎癥狀況和牙周膜再生情況。如圖4A～4C所示，空白組牙周組織結構清晰，結合上皮緊貼牙釉質表面，牙周纖維排列整齊，牙骨質完整，牙周組織內未見炎性細胞浸潤或牙槽骨吸收。然而在牙周炎組（圖4D～4F），上頜第一磨牙和第二磨牙牙間乳頭消失，結合上皮向牙根部遷移形成深牙周袋，牙周纖維結構紊亂，牙骨質中可見吸收性凹坑，牙周組織中可以看到大量中性粒細胞及少量淋巴細胞和漿細胞浸潤，牙槽骨吸收至根尖附近。這些結果表明我們成功地建立了大鼠牙周炎模型。與牙周炎組相比，牙周炎+水凝膠組（圖4G～4I）及牙周炎+FK506組（圖4M～4O）的牙槽骨破壞程度減弱，并可見清晰的嗜堿性反折線，牙周組織內可見少量中性粒細胞浸潤。在牙周炎+載FK506水凝膠組（圖4J～4L）中，幾乎沒有炎性細胞浸潤或牙槽骨破壞，牙骨質完整，并且可以在根叉區及上頜第一磨牙與第二頜磨牙之間看到新生骨組織，牙周狀況與空白組相比，差異無統計學意義。HE染色結果顯示，FK506與可注射溫敏型水凝膠聯合應用（牙周炎+載FK506水凝膠組）可以有效地控制炎癥，促進牙周組織再生。整個實驗過程中由于結扎線的刺激，3個實驗組中的牙間乳頭和結合上皮并未完全恢復。

圖3各組Micro-CT相關參數比較Figure 3 Comparison of Micro-CT related parameters of each group

圖4牙周組織HE染色結果Figure 4 HE staining of the periodontium

為了進一步研究載FK506水凝膠的抗炎作用，我們采用免疫組織化學染色法觀察牙周組織中炎癥因子COX-2和MMP-9的表達水平。與空白組相比，牙周炎組的牙周組織中有大量COX-2和MMP-9陽性細胞，牙周炎+水凝膠組和牙周炎+FK506組的COX-2和MMP-9陽性細胞數量略有下降，但仍高于空白組；然而在牙周炎+載FK506水凝膠組中只有散在分布的COX-2和MMP-9陽性細胞，這表明水凝膠緩釋FK506有效地控制了牙周組織炎癥。詳見圖5。

圖5牙周組織免疫組織化學染色結果（X400）Figure 5 Immunohistochemical staining results of the periodontal tissue（X400）

2.4 載FK506水凝膠對細胞增殖活性的影響

MTT結果表明，水凝膠及其負載藥物FK506與BMSCs細胞共培養48 h后，細胞增殖趨勢略有增加，但差異無統計學意義（P＞0.05，圖6）。此結果表明水凝膠及其負載藥物不會引起細胞毒性或抑制細胞增殖。

圖6 MTT法檢測載FK506水凝膠對BMSCs增殖活性的影響Figure 6 The effect of FK506-containing hydrogel on the proliferation of BMSCs by MTT method

3 討論

牙周炎是菌斑微生物與宿主免疫系統間復雜的相互作用所致的炎癥性疾病。由牙周炎引起的牙槽骨吸收是成人失牙的首要原因，牙周炎會影響人們的面容美觀，營養吸收甚至心理健康?，F有的牙周治療手段僅能減小牙周袋和根分叉損害的探診深度，部分恢復牙周附著，遭到破壞的牙周組織無法完全恢復其生理結構和功能。牙周炎治療的關鍵一方面是抑制牙周炎癥，另一方面是促進牙周組織再生，而現有的治療方法很難同時實現這兩方面的要求。因此，尋找一種既能控制牙周炎癥，并能進一步實現牙周組織再生與修復的治療手段仍是該領域面臨的難題。

牙周炎發生、發展過程中，在以牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）為主介導的病原體相關分子模式（pathogen associated molecule patterns,PAMPs）作用下[16]，外周血和齦溝中的中性粒細胞、單核/巨噬細胞內模式識別受體被激活，釋放大量的前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）[17]。PGE2通過促進核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappaB ligand,RANKL）表達并抑制骨保護素（osteoprotegerin,OPG）表達從而對破骨細胞的形成起到積極作用。因此，抑制炎性因子如PGE2和MMPs的分泌對于控制牙周炎具有重要作用。研究表明，FK506可通過抑制核轉錄因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）的活性來減少MMPs的產生[18]，通過抑制炎性細胞分泌白細胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）來減少PGE2的產生[19]，進而抑制RANKL的表達，從而阻止破骨細胞的分化并控制牙槽骨的吸收。同時COX-2作為催化花生四烯酸轉化為前列腺素的限速酶,在炎癥反應的啟動環節具有關鍵作用[20]。本研究中，我們用結扎線模擬人的牙結石，促進牙菌斑的積累并引起牙周組織炎癥。HE染色結果顯示，經過載FK506水凝膠處理2周后，牙周組織炎癥反應明顯減輕。同時，免疫組織化學染色結果顯示，牙周炎+載FK506水凝膠組中只有散在的COX-2和MMP-9陽性細胞，這證實了FK506在牙周炎治療中的抗炎作用。

近年來已有諸多研究發現FK506在促進骨組織再生中起重要作用[6-7]。我們目前的實驗結果表明，牙周炎+載FK506水凝膠組與空白組CEJ-ABC平均距離及Micro-CT測得的相關指標差異無統計學意義，這表明FK506在控制炎癥微環境的基礎上還可以促進牙槽骨的再生。

綜上所述，載FK506可注射溫敏型水凝膠可以有效地控制牙周組織炎癥，減輕牙槽骨的破壞程度，在牙周組織再生中具有良好的研究價值和應用前景。