自噬促進口腔鱗狀細胞癌的上皮間質轉化

陳 洋， 尚政軍

（湖北省口腔基礎醫學重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，武漢大學口腔生物醫學教育部重點實驗室，湖北 武漢430072）

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）來源于口腔黏膜鱗狀分化的上皮細胞，是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，以高度局部浸潤性及易發生頸部淋巴結轉移為特征，其常規治療手段為手術切除并輔以放化療[1]。細胞自噬是真核細胞利用溶酶體對細胞器及蛋白質進行降解的過程，以達到自我更新、維持穩態的目的。根據溶酶體接受待降解物質的不同方式，細胞自噬主要有3種形式：微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬。其中巨自噬最為常見，也是通常意義上的自噬，其特征為具有自噬體的形成[2]。越來越多的研究表明，細胞自噬與腫瘤的發生、發展有關[3]。上皮間質轉化（EMT）是指上皮細胞失去極性及細胞間黏附，向間質細胞轉化的現象，其與惡性腫瘤的侵襲、轉移密切相關[4]。然而，現階段關于自噬與EMT的關系在OSCC中尚不清楚。本研究嘗試探索其中的機制，為實現OSCC精準靶向治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

人OSCC細胞系CAL27購買于美國模式培養物集存庫（ATCC）；主要試劑：E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體購于美國CST公司；p62、Beclin1、波形蛋白（Vimentin）抗體、熒光二抗購于武漢三鷹公司。

1.2 饑餓處理

在培養皿上接種合適數量的OSCC細胞CAL27，使用完全培養基培養至細胞密度為70%左右時，更換完全培養基為漢克斯平衡鹽溶液，繼續培養6 h。使用完全培養基培養的細胞為正常組，中途使用漢克斯平衡鹽溶液進行換液處理的細胞為饑餓組。

1.3 Western印跡法

蛋白上樣量為30μg/孔。電泳：濃縮膠內采用60 V，30 min；分離膠內采用120 V，70 min。轉膜：采用恒流200 mA，90 min。室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h。TBST溶液漂洗，加入一抗于4℃下孵育過夜。第2天用TBST溶液洗3次，每次10 min。加入二抗置室溫下孵育1 h。TBST溶液洗3次，每次10 min。發光液孵育3 min后使用成像儀成像。

1.4 細胞免疫熒光實驗

棄去原有培養基，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次，多聚甲醛固定10 min。PBS洗3次，加入3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）置室溫封閉1 h。加入一抗，4℃過夜孵育。PBS洗3次，加入熒光二抗，37℃孵育30 min。PBS洗3次，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色1 min。PBS洗3次后于熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2 結果

2.1 饑餓后CAL27細胞自噬水平增強

Western印跡法結果顯示，使用漢克斯平衡鹽溶液培養CAL27細胞6 h后，與未進行饑餓處理的細胞相比，饑餓組細胞中p62的表達降低，Beclin1的表達增高（圖1），表示饑餓組自噬水平增高。

2.2 自噬增強的CAL27細胞發生了EMT

為探討自噬對EMT的影響，對CAL27細胞進行EMT相關指標的檢測。結果顯示，自噬增強后，其E-鈣黏蛋白下降，N-鈣黏蛋白及波形蛋白表達升高（圖2），且細胞形態變成紡錘樣間質細胞（圖3）。結果證明CAL27細胞在自噬增強后發生了EMT。

圖1饑餓6 h后，Western印跡法顯示CAL27細胞自噬相關蛋白Beclin及p62水平的變化Figure 1 Western blot analysis of expression of Beclin 1 and p62 of autophagy in CAL27 cells after starvation for 6 h

圖2饑餓6 h后，CAL27細胞EMT相關指標的變化Figure 2 The changes of EMT-related markers of CAL27 cells after starvation for 6 h

圖3饑餓6 h后，CAL27細胞形態學的改變（×200）Figure 3 The change of morphology of CAL27 cells after starvation for 6 h(×200)

3 討論

OSCC是全世界排名第8的惡性腫瘤[5]。盡管近年來OSCC在診斷和治療策略等方面取得了巨大進展，但由于其易于復發和轉移，患者的總體5年生存率僅為50%左右[6]。細胞自噬指部分需要降解的細胞內容物被運送到溶酶體進行消化的過程，其主要功能是提供細胞存活需要的能量，維持細胞穩態，實現細胞的自我更新[2]。細胞自噬受到一系列自噬相關蛋白的調節，在饑餓及其他應激條件下，Bcl-2與Beclin1相互解離后，將自噬活化信號向下傳遞，導致微管相關蛋白輕鏈3與p62/SQSTM1聚合物結合，促進自噬小體的形成和待降解物質的降解，此過程表現為Beclin1的升高及p62的降低[7]。細胞自噬在腫瘤的發生、發展過程中扮演著不同的甚至是自相矛盾的角色[8]。在腫瘤發生的早期，細胞自噬可以抑制腫瘤的發生，抑制細胞自噬能夠促進腫瘤的增長[9]。但是，在腫瘤的進展過程中，細胞自噬可以增強腫瘤細胞的放化療抵抗能力，維持腫瘤細胞的氧化代謝活動，抑制腫瘤細胞凋亡[10]。

EMT過程中上皮細胞極性消失，細胞間黏附性降低，細胞形態變為紡錘樣間質細胞形態，細胞的遷移和侵襲能力增強。此外，EMT相關分子的表達也會發生變化，表現為E-鈣黏蛋白表達降低，N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達增高[11]。研究證明，EMT與多種腫瘤的侵襲和轉移密切相關[12-13]。

細胞自噬參與了EMT并具有促進和抑制EMT的雙重作用。有學者發現，Beclin1的減少能引起自噬抑制，可以活化胃癌細胞中的低氧誘導因子-1a（hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a），誘導EMT的發生[14]。也有學者發現，上調AEG-1基因可以誘導自噬的持續激活，使肝癌細胞TGF-β1自分泌水平上調，并通過激活轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad3信號通路促進肝 癌細胞EMT的發生[15]。

但目前為止，細胞自噬與EMT在OSCC中的相關機制尚不清楚。本研究饑餓誘導CAL27細胞發生自噬，Western印跡法證明其自噬水平增高。隨后利用Western印跡法和免疫熒光技術檢測其EMT相關指標的變化，發現CAL27細胞發生自噬后，其E-鈣黏蛋白表達量降低，N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達量增高，且細胞形態轉變為紡錘樣間質細胞形態。由此推斷，自噬的激活可以促進OSCC細胞發生EMT，使用特異性自噬抑制劑可以阻止腫瘤細胞發生EMT，這為OSCC的臨床治療提供了新的思路。