JAK2/STAT3通路在雌激素缺乏相關骨髓間充質干細胞衰老中的作用初探

武文婧， 傅稼耀， 魏 玉， 馬鵬飛， 吳珺華

（上海牙組織修復與再生工程技術研究中心，同濟大學口腔醫學院，同濟大學附屬口腔醫院口腔修復科，上海200072）

絕經后骨質疏松給口腔修復及種植帶來困難。前期研究表明，骨髓間充質干細胞（BMSCs）衰老可能在雌激素缺乏相關骨丟失中發揮重要作用[1]。細胞衰老是在端?？s短、氧化應激、DNA損傷等誘因下發生的細胞增殖能力進行性、不可逆的喪失[2]。衰老的細胞除自身受損外還會分泌可溶性炎性壞死因子，即衰老相關分泌表型（senescent-associated secrete phenotype，SASP）。SASP會造成新的細胞衰老，形成惡性循環。JAK2/STAT3信號通路作為調控衰老SASP的重要節點，正日益受到關注。有文獻報道JAK2/STAT3信號通路是調節衰老細胞SASP分泌和生成的關鍵[3]。因此，明確該通路在雌激素缺乏所致BMSCs衰老中的作用，對絕經后骨質疏松的治療有借鑒意義。

1 材料和方法

1.1 BMSCs的提取和培養

將4周齡的雄性小鼠以過量麻醉的方式處死，用75%乙醇浸泡15 min后分離其雙側股骨和脛骨，剪去骭骺兩端。用1 mL注射器吸取含10%胎牛血清（美國Gibco公司），1%青、鏈霉素（中國凱基公司）的α-MEM培養液（美國Hyclone公司），將小鼠骨髓沖入培養皿中，過篩，制備成單細胞懸液。將其置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。每3天更換1次培養液，當細胞密度達到85%~90%時以1∶2的比例進行傳代，并在第3代時進行研究。

1.2 藥物處理

實驗分組：對照組,H2O2誘導組（H2O2組），H2O2誘導+雌激素處理組（H2O2+E2組），H2O2誘導+雌激素+氟維司群（fulvestrant，ICI182,780，美國Sigma公司）處理組（H2O2+E2+ICI182,780組），H2O2誘導+JAK抑制劑處理組（H2O2+JAKi組）。相關處理如下：對照組不做任何處理；H2O2組使用含200μmol/L H2O2的培養液培養BMSCs 2 h，去除上述培養液,磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后用含5μmol/L的H2O2培養液培養24 h維持刺激，以建立BMSCs衰老模型；H2O2+E2組是在H2O2處理的同期將10-7mol/L的E2（美國Sigma公司）添加到培養液中48 h，以體外模擬雌激素的作用。H2O2+E2+ICI 182，780組是在H2O2及E2處理前24 h加入100μmol/L的氟維司群，以抑制雌激素受體，抵消E2的作用；H2O2+JAKi組是在H2O2處理的同期將6×10-5mol/L的魯索替尼加入培養液中作用48 h以抑制JAK2/STAT3信號轉導。

1.3 RNA提取及qPCR檢測

使用RNAiso Plus試劑（日本Takara公司）提取細胞總RNA，使用PrimeScriptTMRT試劑盒（日本Takara公司）進行逆轉錄。然后使用SYBR Green熒光染料試劑配置反應體系。用LightCycler qPCR儀（瑞士Roche公司）進行擴增反應及分析，以GAPDH作為內參，通過2-ΔΔCt方法計算mRNA的倍數變化，并根據對照組對數據進行標準化。所用相關基因的引物序列均在文獻中驗證，具體序列見表1。

1.4 Western印跡法

用含有蛋白酶抑制劑混合物（中國威奧公司）的RIPA裂解液（中國碧云天公司）裂解細胞，以12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，并使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）試劑盒（中國碧云天公司）進行定量分析。用本課題組先前發表過的方法[4]進行Western印跡檢測。p53,p21,JAK2,磷酸化的酪氨酸激酶2（phosphorylated janus kinase 2,PJAK2）,STAT3和GAPDH抗體均購自美國CST公司，并以1∶1 000的稀釋倍數使用。磷酸化的信號轉導與轉錄激活子3（phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,PSTAT3）抗體購自中國博士德公司，以1∶500的倍數稀釋并使用。

表1 qPCR引物序列表Table 1 Primer sequences of qPCR

1.5 衰老細胞SA-β-gal染色

將BMSCs接種在6孔板上，根據說明書，使用SA-β-gal染色試劑盒（中國碧云天公司）行SA-β-gal染色。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1∶1 000，美國Sigma公司）染色以鑒定SA-β-gal陽性細胞的比例，顯微鏡下（日本Nikon公司）隨機選取5個視野內的圖像進行統計分析。

1.6 數據統計分析

在圖、表中，數據以平均值±標準差（±s）的形式表示。組間差異用SPSS 24.0軟件進行獨立樣本t檢驗或卡方檢驗分析。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2誘導以建立BMSCs衰老模型

H2O2誘導可上調BMSCs衰老關鍵通路p53/p21的基因和蛋白表達水平（圖1A、1B）。SA-β-gal染色結果也顯示H2O2組較對照組有更多的陽性細胞（圖1C）。qPCR結果顯示，H2O2組的SASP因子（IL1α、IL6、CXCL15、TNFα、NFκB）表達也顯著增加（圖1D）。同時，我們應用Western印跡法檢測了JAK2/STAT3信號通路的改變，發現JAK2、STAT3的磷酸化水平上調，提示JAK2/STAT3信號通路的激活可能與BMSCs的衰老有關（圖1E）。

2.2 雌激素可抑制H2O2誘導的BMSCs衰老

qPCR結果顯示，在H2O2+E2組中加入10-7mol/L的E2后，衰老相關基因p53、p21的表達及SA-β-gal陽性細胞比例較H2O2組明顯降低（圖2A、2B）。同時，SASP因子的轉錄也因E2的加入而下調（圖2C）。在蛋白水平上，p53、p21表達趨勢與基因水平相吻合，且JAK2/STAT3在衰老細胞中的激活可被雌激素抑制（圖2D）。提示JAK2/STAT3可能是雌激素調控BMSCs衰老的潛在靶點。

2.3 JAK2/STAT3信號通路是雌激素調節BMSCs衰老的靶點

qPCR結果顯示，在H2O2+E2組BMSCs中，氟維司群（ICI182,780）可以有效抑制被E2激活的雌激素受體（圖3A）。同時，E2對于JAK2/STAT3通路的抑制作用也被ICI182,780廢除（圖3B）。以上結果說明，JAK2/STAT3是雌激素的下游靶點。

2.4 抑制JAK信號可以緩解H2O2誘導的BMSCs衰老

Western印跡法結果顯示，魯索替尼可有效抑制H2O2刺激下的JAK2/STAT3激活（圖4A），且對細胞衰老p53、p21基因的表達有抑制作用（圖4B、4C）。SA-β-gal染色的細胞陽性率降低（圖4D），SASP因子表達下調（圖4E）也證明了JAK信號的抑制可以挽救BMSCs的衰老。

圖1 H2O2誘導BMSCs衰老及JAK2/STAT3通路激活Figure 1 H2O2 induced senescence of BMSCs and activation of JAK2/STAT3 pathway

3 討論

骨質疏松是一種退行性、代謝性疾病，表現為骨量減少、骨微結構改變,伴發骨折等并發癥，影響患者生活質量[5]。全身性的骨質疏松會加劇頜骨骨丟失，造成牙齒松動、脫落，給口腔修復及種植帶來困難。有研究表明，超過75%的骨質疏松發生于女性[6]，而絕經后的骨質疏松又占了較大比例，其骨丟失程度也更為嚴重[7]。因此，研究雌激素缺乏所導致的骨丟失機制，對于骨質疏松的治療有重要意義。雌激素是卵巢分泌的激素，其在骨組織中通過與雌激素受體ERα、ERβ相結合，直接調控成骨、破骨基因的表達，從而影響骨穩態。此外，雌激素也能調節多種骨組織細胞的各項生理功能，如衰老、自噬和凋亡等，進而維持骨吸收和骨形成的平衡[8]。雌激素與細胞衰老之間的關系正日益受到關注。

圖2雌激素可以挽救H2O2誘導的BMSCs衰老Figure 2 Estrogen rescued H2O2-induced senescence of BMSCs

圖3雌激素通過JAK2/STAT3影響BMSCs衰老Figure 3 Estrogen affected BMSCs senescence through JAK2/STAT3 signaling

圖4抑制JAK2/STAT3可以緩解H2O2誘導的BMSCs衰老Figure 4 Inhibition of JAK2/STAT3 alleviated H2O2-induced BMSCs senescence

細胞衰老是在端?？s短、氧化應激、DNA損傷等誘因下導致的細胞增殖能力進行性不可逆的喪失[2]，即一種持續的細胞周期阻滯。細胞衰老根據誘因不同可以分為復制性衰老、原癌基因誘導的衰老、壓力誘導的成熟前衰老等[9]?，F有的普遍觀點認為，雌激素的缺乏加劇了骨髓微環境中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的含量[10]及炎癥因子的分泌[11]，導致成熟前衰老的發生。為模擬這一現象，我們選用了H2O2作為刺激物。結果顯示，成熟前衰老的關鍵通路p53/p21被激活，SA-β-gal染色陽性細胞增加;而適宜濃度雌激素的加入可以挽救H2O2組的上述衰老改變，證明了雌激素對BMSCs衰老的抑制作用。近年來，雌激素與細胞衰老的關系在多種組織器官中得到證實，如心血管疾病[12]、皮膚老化[13]、神經系統退行性疾病如阿爾茨海默癥[14]等。在表皮細胞中，雌激素能緩解細胞的衰老，增加端粒酶的活性[15]；在骨組織中，雌激素可能參與了多種骨組織細胞衰老的進程。有報道稱，雌激素通過調控ERβ-SATB2的表達調節BMSCs的衰老表型[16]。在本課題前期研究中也發現，雌激素對于成骨細胞和骨細胞的衰老都有抑制作用[17]。但現有的有關雌激素調控骨衰老的研究較少，具體機制仍有待挖掘。

除了對細胞本身穩態的影響，如前所述，雌激素缺乏還會增加誘導衰老的重要因素ROS含量的增加，以及骨髓中炎癥因子如IL1α、IL1β、IL7、IL8、TNF-α、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF）、人巨噬細胞粒細胞集落刺 激 因 子 （human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等[11]的累積，這些炎癥因子會導致內源性骨衰老的發生，最終引起骨穩態的失調[18]。同時，衰老細胞分泌的SASP也加劇了炎癥微環境，炎性因子和細胞衰老互為因果[19]，形成了炎癥因子—細胞衰老—SASP的連鎖反饋，加劇了成骨和破骨的失衡。我們發現，H2O2組SASP因子的表達隨著衰老基因的上調而上調，且受到雌激素的抑制。因此，阻斷以SASP為關鍵節點的惡性循環可能為骨質疏松的治療提供新思路。

JAK/STATs信號通路在調節細胞因子的生成中起到重要作用。JAK家族有4個成員：JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase2,TYK2）。其中JAK1和JAK2涉及炎癥信號轉導及生長激素和其他內分泌和旁分泌信號的作用[20]。STATs包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B及STAT6，是一類經典的轉錄調節因子。JAK的激活繼而激活STATs，使其發生磷酸化修飾后入核，調控目標基因的表達[20]。我們發現，JAK2/STAT3信號通路受雌激素信號調控并與衰老相關通路有同向變化，而雌激素主要通過與雌激素受體ERα、ERβ相結合，調節相應的基因表達而發揮作用。為了進一步探究JAK2/STAT3信號通路與雌激素信號在調控BMSCs衰老時的關系，我們選取ICI182,780來抑制雌激素受體，發現隨著雌激素信號的抑制，JAK2/STAT3的磷酸化水平都被重新激活。因此，我們推測JAK2/STAT3是雌激素調控BMSCs衰老的下游靶點。有研究表明，JAK通路抑制劑可以改變衰老腫瘤細胞SASP的分泌，實現對腫瘤細胞的免疫應答[21]。進一步的研究發現，抑制JAK2/STAT3信號通路可以緩解老齡小鼠脂肪前體細胞SASP分泌的情況[22]，并對增齡性骨質疏松有一定緩解作用。而且，基于我們前幾部分的結果可知，JAK2/STAT3信號通路在雌激素相關的BMSCs衰老中可能也起到了重要作用。因此，明確該通路在雌激素缺乏所致的BMSCs衰老及SASP分泌中的作用對絕經后骨質疏松的治療有借鑒意義。我們選擇魯索替尼（JAK1/2）選擇性抑制劑來進行體外給藥[23]，發現抑制JAK信號后，SASP分泌減少，BMSCs衰老情況有所減輕。這與先前的文獻報道的“JAK的抑制僅能減少SASP分泌，對細胞衰老的相關基因沒有影響”的結論有所差異[24]。但也有研究表明p53、p21是STAT3的直接下游靶點[25]，且我們認為其抑制了SASP分泌就相當于抑制了衰老的傳播，從而導致衰老基因的表達下調。此外，也有報道稱JAK2/STAT3與BMSCs的成骨相關，瘦素可以通過激活JAK2/STAT3來增強BMSCs成脂分化，抑制其成骨分化[26]。因此，JAK2/STAT3有望通過靶向細胞衰老及成骨過程成為治療絕經后骨質疏松的新靶點。

綜上所述，JAK2/STAT3通路可以響應雌激素信號挽救BMSCs的衰老，其可能是絕經后骨質疏松治療的新靶點。