流動注射法測定血紅蛋白與過氧化物酶對H2O2/愈創木酚反應體系的動態催化性能

杜璞 李永生

摘? ? ? 要： 辣根過氧化物酶（HRP）已被廣泛應用于各個領域，但其價格昂貴且不易保存，所以尋找一種可替代HRP的模擬酶意義重大。本研究初步選擇血紅蛋白（Hb）作為模擬酶，利用流動注射光度系統（SP-FIA），在非平衡狀態下對比了Hb與HRP對H2O2/愈創木酚（GA）反應的動態催化性能。結果表明：Hb在弱酸性及高溫環境下其穩定性強于HRP;Hb對H2O2/GA反應體系的催化作用符合米氏方程，可作為一種過氧化物模擬酶使用;在動力學研究中發現，Hb對GA和H2O2的催化活性不及HRP，對GA的親和力強于HRP，對H2O2的親和力弱于HRP。干擾實驗表明，Hb的催化性能可被Co2+、Cu2+、Pb2+、Fe3+、Zn2+ 激活;EDTA和抗壞血酸可抑制Hb，檸檬酸的酸性環境利于Hb催化;EDTA、抗壞血酸及檸檬酸均能抑制HRP。

關? 鍵? 詞：血紅蛋白;辣根過氧化物酶;流動注射光度法;非平衡態;催化活性

中圖分類號：TQ426.97? ? ? ?文獻標識碼： A? ? ? ?文章編號： 1671-0460（2020）11-2467-05

Determination of Dynamic Catalytic Activities of Hemoglobin and

Peroxidase for H2O2/Guaiacol Reaction System by Flow Injection Analysis

DU Pu， LI Yong-sheng

（School of Chemical Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

Abstract： Horseradish peroxidase （HRP） has been widely used in various fields. But it is expensive and hard to preserve， so it will be important to search for an alternative mimetic enzyme. In this paper， taking hemoglobin （Hb） as a mimetic enzyme， dynamic catalytic properties of Hb and HRP to H2O2/guaiacol （GA） reaction under non-equilibrium state were compared by a special flow-injection photometric system （SP-FIA）. The results showed that under weak acidity and high temperature environments， Hb was stronger than HRP in the stability; the catalysis of Hb to the H2O2/GA reaction conformed to Michaelis equation， this proved that it could be used as a simulation enzyme. In the study of dynamics， it was found that its catalytic activity to H2O2 and GA was lower than HRP， the affinity of Hb to GA was stronger than that of HRP， and the affinity of Hb to H2O2 was weaker than that of HRP. The interference tests showed that the catalytic activity of Hb could be activated by Co2+， Cu2+， Pb2+， Fe3+ and Zn2+; EDTA and ascorbic acid would lower the catalytic activity of Hb， but the acidity of citric acid was conducive to the Hb catalysis.

Key words： Hemoglobine; Horseradish peroxidase; Flow-injection analysis; Non-equilibrium state; Catalytic activity

過氧化物酶（peroxidase， POD）存在于真菌、細菌、陸生生物中[1-2]，在有機合成[3]、污水處理[4]、醫學[5]等領域其催化活性被廣泛利用。商用的POD多為辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP），但HRP價格昂貴且不易保存，所以尋找一種來源豐富、可替代POD的模擬酶就顯得尤為重要。血紅蛋白（Hemoglobine，Hb）是脊椎動物紅細胞內的呼吸蛋白，其結構上具有鐵卟啉輔基（血紅素），與HRP結構相似[6]，因此有類似POD性質。HRP只能來源于辣根，而Hb可從豬、牛等脊椎動物血液中提取，其價格僅為HRP的0.2%，所以Hb是一種很好的POD替代酶。

在用Hb替代POD的研究中，蔡汝秀[7]等首次用其測定了H2O2和葡萄糖;席永清[8]等也利用Hb催化L-酪氨酸/H2O2反應用熒光檢測器測定了果蔬中的葡萄糖;王全林[9]等研究了鉻黑-T/Hb/H2O2的顯色反應體系;楊濤[10]等利用固體電極伏安法研究了鄰氨基酚/Hb/H2O2反應體系行為。但Hb相對于HRP的催化性能，很少有人報道。另外，Hb替代HRP的研究多基于手工操作，有人為誤差大、操作繁瑣的不足。

基于流動注射光度法（SP-FIA）的準確度高且重現性好[11-12]的特點，將其用于Hb與HRP的催化性能對比的研究中，以達到實驗數據準確可靠、實驗效率高的目的。本研究首先設計了一種新的SP-FIA系統，并選擇被廣泛應用的愈創木酚? ?（GA）/H2O2反應體系作為Hb與HRP的催化對象，得到的結果為Hb替代HRP提供了理論根據。

1? 實驗部分

1.1? 儀器與試劑

使用的試劑主要有GA、H2O2 （30%，質量分數）、磷酸氫二鈉（Na2HPO3·12H2O）、檸檬酸、濃鹽酸（36%～38%，質量分數）、EDTA、檸檬酸及抗壞血酸（AsA），均為分析純，購于成都科龍化學試劑公司;Hb和HRP， ≥250 U·mg-1，購于Sigma公司;實驗用水為脫氣純水。

使用的儀器主要是FIA-3110流動注射裝置、紫外-可見分光光度計、SHZ-D（Ⅲ）循環/水式多用真空泵、KL-UP-IV-20超純水儀、CP224S電子天平、800-1離心機及pXJ-1C+型離子活度計。

1.2? 試劑配制

磷酸鹽-檸檬酸緩沖液（pH=5.6）：分別稱取71.2 g的磷酸氫二鈉和19.2 g的檸檬酸，溶解后分別移入1.0 L容量瓶中，用水定容，得到0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉、0.1 mol·L-1檸檬酸的兩種溶液;然后，取580 mL的磷酸氫二鈉溶液與420 mL的檸檬酸溶液混合。

GA母液（45 mol·L-1）：移取446 μL GA于100 mL容量瓶中，用純水定容。

H2O2母液（15 mol·L-1）：移取165 μL H2O2? （30%）于100 mL容量瓶中，用純水定容。

HRP溶液（10 kU·L-1）：準確稱取0.001 0 g HRP干粉，溶解后移入25 mL 容量瓶中，用純水定容。

Hb溶液（0.6 mol·L-1）：稱取1.0 g Hb，溶解后轉移至25 mL容量瓶中，用純水定容。

1.3? 酶活性測定原理

在過氧化物酶的催化下，H2O2與GA反應生成3，3′-二甲氧基-4，4′-聯苯二醌（2-GA），該棕色產物在470 nm處有最大吸收[13] （2GA + 2H2O2 + POD → 2-GA + 4H2O）。根據酶活性定義[14]，得到酶活性濃度公式：EPOD = （nV/εvL）（ΔA/Δt）;在本研究的SP-FIA系統中n =2，是棕色產物與GA的摩爾比;ε = 0.006 L·（μmol·cm）-1，是2-GA的表觀摩爾吸光系數;L = 1 cm，是流通池光程;ΔA為峰高;Δt為從樣品注入到最高峰出現的留存時間? ? （0.67 min）;V/v = 5.921，是樣品分散度。因此，當這些參數給定時，Ec值僅與ΔA/Δt相關。

1.4? SP-FIA系統及測定過程

SP-FIA流路見圖1，由蠕動泵（P）、多功能閥（V）、流通式光度檢測器和計算機組成。其測定過程為：當多功能閥處于“采樣”位時兩個泵同時運行，酶樣和GA/H2O2試劑在P2抽吸下充滿樣品定量環（SL）和試劑定量環（RL），多余液體排廢（W），載流磷酸鹽-檸檬酸緩沖液將定量環中“清洗液塞”推入反應盤管（RC）和流通池，此時得到空白吸光度值（A0）;當該閥轉到“注入”位，P2停止，P1推動注入同一載流中的“酶試樣塞”和“GA/H2O2試劑塞”進行追趕滲透，進入RC中反應，生成棕色產物，流通檢測器給出其吸光度值（A）;最后根據吸光度差（ΔA=A-A0）定量酶活性。

RC—反應盤管; SL—樣品定量環; RL—試劑定量環; CL—清洗劑定量環。

2? 結果與討論

2.1? FIA系統的參數優選及其性能的考察

在文獻基礎上[15]，用HRP標液作為測試樣品，進一步考察了SP-FIA系統流速、樣品及試劑的注入體積、反應盤管長度對Hb催化生成的棕色產物吸光度的影響，得到的結果是：流速為1.91 mL·min-1，樣品注入體積為40 μL，試劑注入體積為150 μL，反應盤管長度為150 cm，清洗液濃度為0.4 mol·L-1 HCl，注入量為150 μL。

考察了系統的重復性和線性。在上述優選條件下，GA（4.5 mol·L-1）+H2O2（1.5 mmol·L-1）混合液作為試劑，10、30 μmol·L-1 Hb作為測試樣品，進行了11次重復檢測，得到的RSD小于4%，這證明本系統重現性良好。隨后用一系列Hb標液作為測試樣品考察了系統的線性，結果表明在? ? ?5～40 μmol·L-1 Hb范圍內，系統線性響應良好（ΔA = 0.019CHb + 0.037 6，R2=0.992），檢出限能達到? ?0.47 μmol·L-1，可以用該系統對Hb和HRP進行比較研究。

2.2? pH對Hb和HRP催化活性和穩定性的影響

酶蛋白分子側鏈的解離狀態受到酸堿環境影響，會使酶本身失活或影響與底物的結合。因此，其他條件不變，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液（pH=2.2～8.0）作為系統的載流，考察了Hb和HRP 的最適pH值，到的結果見圖2。結果表明，Hb和HRP催化GA/H2O2反應形成的棕色產物吸光度均隨pH增加先增大后減小，在pH=4.6時Hb催化產物吸光度最大（圖2a），pH=6.0時HRP催化產物吸光度最大（圖2b）。這表明，Hb在偏酸性時、HRP在中性時具有較高的催化活性，但兩者在偏堿性環境中催化活性很低。

繼續考察了不同酸度環境下Hb和HRP的穩定性。將20 μmol·L-1 Hb及300 U·L-1 HRP標液與不同酸度的緩沖液按1∶1混合后，在4 °C下保存24 h，然后作為測試樣品，注入SP-FIA系統進行測定，原始混合液的催化活性定為100%，結果見圖2c。結果表明，Hb的相對催化活性在pH=2.2～3.0環境中約為20%，當pH>3.0時Hb的催化活性隨pH增加而急增，在pH=4.6～5.6時達到95%～100%，當pH>5.6時Hb活性急劇下降;對于HRP，在pH =2.2～3.6時完全失活，當pH >3.6時HRP活性隨pH增加而增大，當pH=5.6～7時活性穩定在95%～100%之間，當pH >7時其活性降低。得到的結論是：在中性、堿性環境中HRP穩定性強于Hb，在pH=5.6時Hb及HRP穩定性均好。因此，在研究Hb和HRP酶學性質時，緩沖液酸度定為pH=5.6。

2.3? 溫度對Hb和HRP催化活性和穩定性的影響

高溫會改變酶蛋白質的空間結構，從而影響其催化活性。因此，本實驗考察溫度對Hb和HRP的催化活性的影響。pH=5.6的緩沖液作為載流，其他條件不變，400 U·L-1 HRP及10 μmol·L-1 Hb作為測試樣品，SP-FIA系統的RC置于恒溫水浴，得到的結果見圖3a。在25～85 ℃范圍Hb及HRP受溫度的影響趨勢類似，在44 ℃時催化產物的吸光度最高，所以在動態反應下Hb和HRP的最適溫度為44 ℃。

在不同溫度下Hb及HRP保留1 h后，考察了Hb和HRP的熱穩定性。將裝有Hb和HRP溶液的試管放在恒溫水浴內1 h后，取出冷卻至室溫。未加熱的原始Hb、HRP的催化活性定為100%，實驗結果如圖3b。在35～85 ℃范圍Hb的催化活性為95%～100%，當超過85 ℃時Hb活性開始降低;在35～45 ℃范圍，HRP的催化活性約為95%，當超過45 ℃后催化活性迅速下降，95 ℃時HRP完全失活。因此得出結論：Hb的溫度耐受性遠高于HRP，在35～85 ℃下Hb穩定性良好;HRP在45 ℃以下穩定性較好，高于45 ℃其穩定性明顯變差。

2.4? 底物濃度對Hb和HRP催化活性的影響

利用GA/H2O2/POD反應體系定量酶的催化活性時，GA/H2O2濃度會影響定量Hb或HRP催化性能的響應信號，因此首先固定注入的Hb或HRP樣品濃度及H2O2濃度（1.5 mmol·L-1），改變GA/H2O2混合液中的GA濃度（0.1～4.5 mmol·L-1），評價了GA濃度的影響。圖4a結果表明，Hb催化產物的吸光度值隨GA濃度增加而增大，超過3 mmol·L-1時產物吸光度趨于穩定;HRP的催化產物吸光度在0～3 mmol·L-1GA范圍內，線性增加，超過? ? ? ? 4.5 mmol·L-1后產物吸光度不再變化。

GA濃度定為1.5 mmol·L-1，改變GA/H2O2混合液中的H2O2濃度（0～50 mmol·L-1），其他條件如上，評價了H2O2濃度的影響。圖4b結果表明，Hb催化產物的吸光度隨H2O2濃度線性增加而增大，超過40 mmol·L-1時產物吸光度不再變化;在? ? 0～1 mmol·L-1 H2O2的范圍內，HRP的催化產物吸光度線性增加，超過1.5 mmol·L-1后，產物吸光度不再變化。這說明以GA和H2O2為底物時Hb和HRP催化反應均符合Michaelis-Menten動力學規律。

在此實驗中，進一步考察了GA/H2O2/Hb （HRP）反應體系相關的動力學參數Km和vm。在Hb催化下GA 為底物時得到的 Lineweaver-Burk 雙倒數圖見圖4c，由曲線 （y = 2.011 8x + 2.881 8，r =0.993 8）得到KmHb為0.698 mmol·L-1，vmHb為0.347 mmol·（L·min） -1;HRP催化下以GA為底物時的雙倒數曲線見圖5c，由曲線（y = 2.071x + 0.282 9，r = 0.996）得到KmHRP為7.37 mmol·L-1，vmHRP為3.56 mmol l·（L·min） -1。由于KmHb < KmHRP，所以Hb對GA的親和力強于HRP;由于vmHRP > vmHb，所以當GA為底物時，Hb的催化活性小于HRP。

在Hb催化下以H2O2為底物時得到的雙倒數曲線見圖4d，由曲線（y = 3.682 8x + 0.785 5，r = 0.999）求出以H2O2為底物時Hb的KmHb為4.68 mmol·L-1，vmHb為1.27 mmol·（L·min） -1。在HRP催化下H2O2為底物時的雙倒數曲線見圖4d，由曲線（y =? ?0.960 4 x+0.352 2，r =0.997）求出HRP的KmHRP為2.73 mmol·L-1，vmHRP為2.84 mmol·（L·min）-1。由于KmHb > KmHRP，所以Hb對H2O2的親和力弱于HRP;vmHb

3? 干擾實驗

在Hb和HRP樣品中分別加入Co2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+ （0.1 mmol·L-1），考察了它們的影響。結果表明，Co2+、Cu2+及Pb2+對Hb和HRP均有激活作用，對Hb的激活作用相對較大;Fe3+和Zn2+對Hb催化有激活作用，而對有HRP催化抑制作用，抑制作用由大到小順序為Fe3+、Zn2+;針對Hb的激活作用由大到小順序為Zn2+、Pb2+、Cu2+、Fe3+、 Co2+;針對HRP的激活作用由大到小順序為Pb2+、 Cu2+、Co2+。

在Hb和HRP樣品中又添加EDTA （0～0.8 mmol·L-1）、檸檬酸（0～0.2 mmol·L-1）及AsA（0～0.2 mmol·L-1），考察了這3種抑制劑對Hb和HRP催化活性的影響。結果表明，這3種物質都抑制HRP的催化活性，抑制強度由大到小順序為檸檬酸、AsA、EDTA。HRP催化活性降低是由于EDTA及檸檬酸可螯合HRP活性中心Fe2+，AsA可與催化產物反應，導致計算結果呈負偏差;EDTA和AsA也抑制Hb催化活性，表現為濃度增加，Hb催化活性減小;但在0～0.2 mmol·L-1范圍內，檸檬酸濃度增加會使Hb催化活性增強，因為Hb的最適pH為4.6，檸檬酸濃度增大使反應體系pH接近了此值，即氫離子對Hb催化活性的正影響大于檸檬酸螯合造成的負影響。AsA濃度對Hb、HRP的催化活性是負影響，并與催化產物的信號呈負的線性相關（ΔAHb = -0.017CAsA + 0.219，R2=0.999 5;ΔAHRP = -0.456CAsA + 0.214，R2 = 0.991 5）。

4? 結 論

Hb在弱酸性及高溫環境下其穩定性強于HRP;Hb催化H2O2/GA反應體系符合米氏方程，可作為一種過氧化物模擬酶使用;Hb對GA的親和力強于HRP，對H2O2的親和力弱于HRP，Hb對GA和H2O2催化活性低于HRP。Hb的催化性能可以被Co2+、Cu2+、Pb2+、Fe3+、Zn2+激活;Fe3+、Zn2+對HRP的酶活性起抑制作用;檸檬酸的酸性環境利于Hb催化。綜上所述，Hb可作為一種HRP的替代物使用。

參考文獻：

[1]PASSARDI F， COSIO C， PENEL C， et al. Peroxidases have more functions than a Swiss army knife[J]. Plant Cell Rep.， 2005， 24（5）： 255-265.

[2]ALMAGRO L， G?MEZ ROS L V， BELCHI-NAVARRO S， et al. A.Class III peroxidases in plant defence reactions[J]. J. Exp. Bot.， 2009， 60（2）： 377-390.

[3]WANG S， WANG Q， FAN X， et al. Synthesis and characterization of starch-poly （methyl acrylate） graft copolymers using horseradish peroxidase[J]. Carbohyd. Polym.， 2015， 136（9）： 1010-1016.

[4]程龍.辣根過氧化物酶在多壁碳納米管/堇青石復合載體上的固定化及含油污水處理[D].北京：北京化工大學，2015.

[5]SAA L， GRINYTE R. Blocked enzymatic etching of gold nanorods：application to colorimetric detection of acetylcholine- sterase activity and its inhibitors[J]. ACS Appl. Mater. Inter.， 2016，8（17）：11139-11146.

[6]ZWART A， BUURSMA A， VAN K E J， et al. Multicomponent analysis of hemoglobin derivatives with reversed-optics spectrophotometer.[J]. Clin. Chem.，1984，30（3）：373-379.

[7]黃應平，蔡汝秀.血紅蛋白作為過氧化物模擬酶催化顯色體系的研究與應用[J].分析化學，2001，49（4）：378-382.

[8]席永清，邱海鷗，楊明，等.血紅蛋白模擬酶催化熒光法測定葡萄糖[J].分析化學，2008， 36（10）：40-45.

[9]王全林，呂功煊.基于血紅蛋白的過氧化物酶特性測定其在血漿中游離態含量[J].分析化學，2003，31（8）：945-949.

[10]楊濤，王增健，焦奎，等.血紅蛋白模擬過氧化物酶催化H2O2氧化鄰氨基酚的固體電極伏安法研究[J].分析試驗室，2006， 25（3）：1-4.

[11]張吉良.氣體擴散—流動注射分光光度法測定水中氟[J]. 沈陽化工（當代化工）， 1994（3）：53-55.

[12]趙珍義，馬成龍，陳華. FIA—雙光束分光光度法測定天然水中微量鐵[J]. 沈陽化工（當代化工），1992（5）：32-34.

[13]HWANG S， LEE C H， AHN I S. Product identification of guaiacol oxidation catalyzed by manganese peroxidase[J]. J. Ind. Eng. Chem. ， 2008， 14（4）： 487-492.

[14]IUB N C. Nomenclature committee of the international union of bio- chemistry （NC-IUB）-units of enzyme-activity-recommendations 1978 [J]. Eur. J. Biochem. ， 1979， 97（2）： 319-320.

[15]李永生，鄭巍，高秀峰.基于流動注射光度法的吸光度/留存時間比自動測定過氧化物酶活性方法[J].分析化學，2015， 43（10）：1580-1588.