紅汁乳菇中一個聚酮合酶基因的鑒定和表達分析

原曉龍， 羅 婷， 王 毅， 李云琴， 楊文忠

(云南省林業和草原科學院 云南省森林植物培育與開發利用重點實驗室/國家林業和草原局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室, 云南 昆明 650201)

源于動植物或微生物的聚酮化合物數量龐大、結構豐富，是由許多分子量較小的低級羧酸通過連續縮合反應產生[1]。聚酮化合物具大環內酯類、四環類、蒽醌類和聚醚類結構[2]，且因其廣泛

的生理活性而被用于大多數重大疾病治療的臨床用藥，正因為這些特性，使聚酮化合物擁有了巨大的新藥開發潛力和商業應用價值[3]。聚酮化合物獨具合成機制和較強的可塑性，為研究聚酮化合物合成酶催化的分子機制、分子識別和蛋白互作，通過組合生物學的手段獲得具有新型骨架的聚酮化合物提供了契機[4]。真菌中的聚酮化合物由含多結構域的重復型聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)催化形成[5]；真菌中的PKS可進一步分為非還原型(NR-PKS)、部分還原型 (PR-PKS)和高度還原型(HR-PKS)[2-3]。NR-PKS通常含有一個作為選擇起始單元的ACP?；D移酶結構域(SAT)，用作聚酮鏈延伸的結構域β-酮體合成酶(KS)、?；D移酶(AT)、產物模板結構域(PT)、?；d體蛋白(ACP)；位于NR-PKS鏈延伸結構域末端的結構域高度變化，包括硫酯酶 (TE)、甲基轉移酶(MT)和還原酶(R)結構域[2,6]，其中KS、AT、ACP是最基本的結構域，AT負責延伸單元的轉移，而聚酮側鏈的長度可能由KS結構域決定[7]。在非還原型聚酮化合物中，苔色酸(Orsellinic acid)可能是一種最簡單的四肽，由作為起始單元的乙?；鶊F和3個作為擴展單元的丙二?；鶊F縮合形成[7]。合成阿維拉霉素(avilamycin)的合成酶AviM[8]及合成calicheamicin的CalO5[9]等苔色酸合成酶(Orsellinic acid synthase, OSAS)均含有KS、AT和ACP結構域。紅汁乳菇(Lactariushatsudake)又名美味松乳菇、雁鵝菌，屬于層菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)紅汁乳菇科(Russulaceae)乳菇屬(Lactarius)真菌[10]，主要分布在我國河北、遼寧、吉林、江蘇、浙江、湖南、四川、青海和臺灣等省份[11]。紅汁乳菇是一種營養價值豐富、主要生長在松林中的外生菌根菌[12]。紅汁乳菇的粗提物具防癌抗癌及抗菌作用[13-14]，子實體中含有豐富的人體必需氨基酸、粗蛋白、多糖、維生素和煙酸，是一種理想的低脂高蛋白食品[15]。本研究以紅汁乳菇基因組為基礎進行基因挖掘，分離到1條可能產生苔色酸的NR-PKS基因，通過RT-PCR克隆得到該基因全長cDNA序列(LhPKS1)，通過生物信息學分析及預測該基因的功能，并比較了該基因在含不同濃度碳源添加物和在不同氮源培養基上的具體表達量，為紅汁乳菇的PKS基因挖掘、預測以及通過改變培養條件，提高紅汁乳菇中聚酮化合物含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 從云南省宜良縣采集菌蓋大小適中、完整，菌褶完好的紅汁乳菇新鮮子實體并編號，采用食用菌組織分離法，將子實體用75%的酒精消毒，在無菌條件下將子實體切碎后接種在MY斜面培養基上，28 ℃避光培養15 d，當菌落直徑達到1 cm左右時，選擇無雜菌污染的菌絲轉接到新的MY培養基上。將經ITS鑒定的紅汁乳菇菌絲體接種在含不同氮源添加物的培養基上，28 ℃培養30 d后，采集菌絲體用于檢測LhPKS1基因的具體表達情況。

1.1.2 培養基 ①碳源培養基：以6.0 g/L的麥芽浸粉和3.0 g/L的酵母提取物為基礎，分別添加2.0 g/L和10.0 g/L麥芽糖、甘露糖、果糖、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、肌醇和可溶性淀粉，配制成不同碳源的培養基；②氮源培養基：以1.8 g/L的麥芽糖和6.0 g/L的葡萄糖為基礎，分別將6.0 g/L的大豆蛋白胨、馬鈴薯浸粉、牛肉浸粉、胰蛋白胨和番茄浸粉為氮源添加物添加其中，配置不同的氮源培養基；③固體培養基：在①、②培養基的基礎上添加8 g/L的瓊脂，將無雜菌污染的紅汁乳菇菌絲體接種到培養基上，28 ℃恒溫培養30 d，用于觀測紅汁乳菇菌絲體的生長情況。將紅汁乳菇菌絲體接種在不添加瓊脂的液體培養基中，28 ℃、120 r/min震蕩培養30 d，用于檢測LhPKS1基因在不同培養基上的具體表達情況。

1.1.3 儀器與設備 PCR儀(Bio-Rad C1000)，紫外分光光度計(Thermo Scientific, NanoDropTM2000)，凝膠成像儀(Azure Biosynstems C1000)，電泳儀(Bio-Rad)，恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)，無縫連接試劑盒(賽默飛世爾科技公司，美國)，總RNA提取試劑盒(Biomiga，中國)，反轉錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)，高保真DNA聚合酶(Biomiga, 中國)。

1.2 方法

1.2.1 紅汁乳菇LhPKS1基因全長cDNA的克隆 以密褐褶菌(Gloeophyllumtrabeum)的聚酮合酶基因(XP_007866703)為模板，采用本地Blast對紅汁乳菇基因組數據進行搜索獲得1條與其序列較為相似的DNA序列，以此DNA序列為基礎，采用無縫連接試劑盒快速克隆獲得紅汁乳菇PKS基因的全長cDNA。具體方法：采用真菌總RNA提取試劑盒提取紅汁乳菇子實體的總RNA，并采用反轉錄試劑盒將質量和完整性較好的紅汁乳菇總RNA反轉錄成cDNA，儲存于-20 ℃冰箱中；以搜索獲得的DNA序列為基礎，設計含有起始密碼子的LhPKS1F0(5′-TACCCCCGAGATAACGAA-AG-3′)、LhPKS1R0(5′-AAAGCCTCATAGTAACTAGG-3′)，和LhPKS1F1(5′-ATGCCACTCTATCCTGGTGA-3′)終止密碼子的LhPKS1R1(5′-CACGTATGCTGAAAGCATGA-3′)；以紅汁乳菇子實體cDNA為模板，以LhPKS1F和LhPKS1R為引物，用高保真DNA聚合酶分別擴增出LhPKS1基因的5′和3′端片段；這兩個片段經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳純化后，再采用無縫連接試劑盒將這兩個片段連接，獲得LhPKS1基因的全長cDNA；經轉化、菌落PCR后，選擇陽性克隆進行測序。

1.2.2 采用生物信息學分析LhPKS1基因 利用DNA man軟件剔除LhPKS1基因測序結果中的載體序列，并將其提交到NCBI獲取GenBank登錄號。然后采用ORF Finder、 ProtParam、SignalP 4.1 Server、TMHMM和TargetP等在線程序(具體網址見表1)分別進行蛋白序列預測、理化性質分析、信號肽和跨膜結構域查找及細胞定位等操作。將LhPKS1蛋白序列在NCBI上進行BLAST同源比對，然后從搜索結果中選擇同源性較高的蛋白。將這些真菌的PKS蛋白作為一個整體放置于MEGA 6.0軟件中，通過多序列比對，以臨位相接法(neighbor-joining)進行1 000次重復的方式構建系統進化樹。

1.2.3LhPKS1基因在含不同碳源添加物培養基上的表達 從各液體培養基中收獲0.5 g菌絲體并迅速瀝干，用真菌總RNAextract kit提取總RNA，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳和Nano DropTM2000檢測后，選擇濃度合適和完整性較好的RNA，取出2 μg按照反轉錄試劑盒的說明將其反轉錄成cDNA。采用10 μL體系，cDNA 1μL，特異檢測引物TLhPKS1F(5′-AGCATACGACGTATATT-T-3′)和TLhPKS1R(5′-ATATTGTATATGTACAAG-3′)各1 μL，PCR mix 5 μL，ddH2O 2 μL進行PCR擴增以比較LhPKS1基因在各培養基上的表達水平。將2.5 μL各擴增產物和DNA Marker在1.2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。條帶亮度強弱能夠反映該條帶DNA的含量，在凝膠電泳圖上，相同大小條帶的亮度能夠體現出基因表達的強弱，電泳結束后利用圖片分析軟件GENE-SNAPS分析同一背景條件下各擴增產物相同面積的積分光密度值，根據積分光密度值繪制柱狀圖可反映基因表達的強弱[16]。因此，利用PCR技術與凝膠電泳圖分析軟件相結合的方式，將電泳圖片中的條帶數據化，以分析不同PCR擴增產物條帶的積分光密度，以此數據為基礎繪制柱狀圖，可反映出同一基因表達的強弱。

表1 生物信息學在線網址

2 結果與分析

2.1 不同培養基紅汁乳菇菌絲生長情況比較

將紅汁乳菇菌絲體接種在添加了不同碳源和氮源添加物的培養基上，28 ℃恒溫培養30 d。結果顯示，不同碳源和氮源添加物對紅汁乳菇菌絲體生長情況影響差異顯著。以麥芽浸粉和酵母提取物為氮源，以葡萄糖等8種糖作為碳源添加物時，含 2 g/L蔗糖的培養基培養的紅汁乳菇菌絲體的直徑最大，含10 g/L葡萄糖培養基培養的紅汁乳菇菌絲體直徑最大。紅汁乳菇菌絲體的生長在不同的碳源添加物濃度下，僅葡萄糖隨濃度增加而呈現菌絲體直徑增加，麥芽糖差異不大，其余糖類均表現為隨濃度增加而生長減弱的趨勢，說明紅汁乳菇菌絲對葡萄糖的需求較大，見表2。以麥芽糖和葡萄糖作為碳源，紅汁乳菇菌絲在5種不同氮源添加物的影響下，其生長趨勢表現為番茄浸粉和馬鈴薯浸粉大致相同，其余依次表現為大豆蛋白胨>胰蛋白胨>牛肉浸粉，說明番茄浸粉和馬鈴薯浸粉能顯著影響紅汁乳菇菌絲體的生長，見表3。

表2 不同濃度碳源添加物對紅汁乳菇菌絲體生長的影響Table 2 Effect of different concentrations of carbon additives on mycelia of L.hatsudake

表3 不同氮源添加物對紅汁乳菇菌絲體生長的影響

2.2 LhPKS1基因全長cDNA的克隆

以密褐褶菌的PKS基因(XP_007866703)為模板，本地Blast搜索紅汁乳菇基因組，分離獲得LhPKS1基因，并以含有起始密碼子和終止密碼子的引物采用無縫連接克隆獲得該基因的全長cDNA。結果顯示，LhPKS1基因全長6 036 bp，可編碼2 011個氨基酸殘基；通過與其同源的聚酮合酶蛋白序列比對發現(圖1)，紅汁乳菇LhPKS1蛋白含有聚酮合酶的結構域依次為SAT-KS-AT-PT-ACP-TE，保守氨基酸位點分別為SAT(GILGFSSGIL)、KS(VVDTACSSSL)、AT(LVVGHSLGEY)、PT(GHRVRGRPLCPAS)、ACP(LLGLDSLASIEAH)和TE(GWSFGGIIAFEI)，括號內粗體字代表保守氨基酸。

2.3 LhPKS1蛋白生物信息學分析

通過對克隆獲得LhPKS1基因全長cDNA的生物信息學分析發現，該基因編碼2 011個氨基酸，其分子式為C9770H15377N2669O2884S69，相對分子質量為218.58 kDa，理論等電點pI為6.19，不穩定系數為44.74，屬不穩定蛋白，脂肪族指數為97.12，該蛋白無信號肽序列存在，無跨膜結構域，定位于細胞質基質中發揮作用。通過紅汁乳菇LhPKS1蛋白與其他同源性較高的20種真菌PKS的分子系統進化樹(圖2)，結果顯示共有5個分支，紅汁乳菇LhPKS1(MN563182)、氈蓋邦氏孔菌(Bondarzewiamesenterica, THH20593)、密褐褶菌(Gloeophyllumtrabeum, XP_007866703)和傘菌綱真菌(Agaricomycetessp., APH07628)聚為一支，推測其合成的聚酮化合物為苔色酸；其余4支生物合成的可能聚酮化合物依次為四羥基萘、乙酰四羥基萘、降盤散衣酸和間二羥基苯甲酸大環內酯類。

2.4 LhPKS1基因在含不同濃度碳源添加物培養基上的表達

將紅汁乳菇接種在含不同氮源和不同碳源添加物的培養基上，28 ℃恒溫培養30 d后，采用TLhPKS1F和TLhPKS1R檢測LhPKS1基因的具體表達量。結果顯示(圖3)，在含有不同濃度和不同種類碳源添加物的培養基上，該基因表達差異明顯；在2 g/L濃度的含不同碳源添加物培養基上，LhPKS1基因表達量從高到低依次為山梨醇、可溶性淀粉、麥芽糖、果糖、甘露糖、肌醇、蔗糖、葡萄糖；在10 g/L濃度的含不同碳源添加物的培養基上，LhPKS1基因的表達量從高到底依次為肌醇、山梨醇、麥芽糖、可溶性淀粉、甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖；在同一濃度的氮源添加物培養基上，LhPKS1基因的表達量從高到低依次為番茄浸粉、大豆蛋白胨、牛肉浸粉、馬鈴薯浸粉。這些現象表明不同的培養基成分及其濃度對LhPKS1基因的表達影響差異顯著，成分不同、濃度不同均可影響該基因的表達，說明該基因對營養成分具有一定的選擇性。

圖1 紅汁乳菇LhPKS1蛋白保守位點分析(框內為活性保守氨基酸)Fig.1 The different active conserved sites of LhPKS1 in each domains (the conserved active site marked in frame)Lh：紅汁乳菇(MN563182)；Gt：密褐褶菌(XP_007866703)；Hs：Heliocybe sulcata (TFK52663)；Hm：蟹味菇(RDB14789)；Ao：奧氏蜜環菌(SJL00722)Lh: Lactarius hatsudake (MN563182); Gt: Gloeophyllum trabeum (XP_007866703); Hs: Heliocybe sulcata (TFK52663); Hm: Hypsizygus marmoreus (RDB14789); Ao: Armillaria ostoyae (SJL00722)

圖2 LhPKS1與其他真菌PKS酶蛋白的分子系統進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of LhPKS1 and other PKS enzyme protein from fungus

圖3 不同培養條件下LhPKS1基因的表達量 Fig.3 The expression levels of LhPKS1 gene in the different medium

3 討 論

紅汁乳菇不僅分布廣泛、營養豐富且味道鮮美[11]，還具有獨特的藥理作用，其水提物能夠有效抑制小白鼠肉瘤和艾氏腹水瘤，抑制率分別達到100% 和90%，抗癌防癌作用明顯[14]，對大腸埃希菌、沙門氏菌等也具一定的抗菌作用[13]。鑒于紅汁乳菇具有多樣的生物活性，而且目前對紅汁乳菇基因方面的研究較少，本研究從基因水平出發，采用基因組挖掘方式研究紅汁乳菇中的聚酮合酶基因及其具體功能。隨著測序技術的迅速發展，以生物信息學分析為基礎分離及克隆特定基因已成為一種較為普遍的研究方法，本研究克隆得到紅汁乳菇基因組中的1個PKS基因，其結構域依次為SAT-KS-AT-PT-ACP-TE，因其含有簡單分子生物合成的起始單元SAT結構域，該結構域是組成NR-PKS的典型結構域之一，PT結構域亦為NR-PKS的識別特征結構域[6]，故LhPKS1屬于NR-PKS。通過對與LhPKS1蛋白同源性較高的真菌進行聚類分析發現，其系統進化樹分為5個分支，其最終的催化合成產物分別為四羥基萘、乙?；牧u基萘、降盤散衣酸、間二羥基苯甲酸大環內酯和苔色酸；LhPKS1歸屬于合成大環內酯類中的苔色酸的一支，因其與傘菌綱(Agaricomycetes sp.)真菌編碼苔色酸生物合成的PKS2基因(APH07628)同屬于一支；將PKS2的功能通過在黑曲霉(A.niger)上異源表達得到確定[17]。比較其他終產物為苔色酸的結構域，發現LhPKS1與構巢曲霉(A.nidulans)的orsA基因[18]、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的pks14基因[19]的結構域及其順序均一致。綜上所述，LhPKS1蛋白聚在參與苔色酸生物合成的分支中。

不同的培養條件及不同的營養物質均可影響真菌中特定基因的表達水平，通過改變培養基成分和培養條件、液體培養基的滲透壓、添加酶促進劑或抑制劑等均可影響不同基因或基因簇的表達。本研究通過控制其他培養條件，僅改變培養基中的碳氮源添加物及其濃度來探究不同糖類或提取物對LhPKS1基因表達的影響，結果顯示，LhPKS1基因在含不同濃度和不同種類碳源添加物的培養基上，表達量差異明顯。紅汁乳菇菌絲體的生長情況與LhPKS1基因的表達量存在一定程度的差異，具體表現為在含不同濃度碳源添加物的培養基上，LhPKS1的表達量變化差異顯著，如以肌醇作為碳源添加物，該基因在含10 g/L肌醇培養基上的表達量是2 g/L肌醇表達量的11.8倍；而以果糖作為添加物，二者表達量近似；同時以山梨醇為碳源添加物，2 g/L和10 g/L的山梨醇含量均較高，說明高濃度肌醇和不同濃度的山梨醇均為LhPKS1基因的強誘導表達物。在含不同氮源添加物的培養基上，LhPKS1基因在含番茄浸粉的培養基上表達量最高。這種培養策略叫單株多產物(One strain many compounds, OSMAC)[20]，Nielsen等[21]采用該策略通過篩選各培養基及其配方發現YES培養基可強烈刺激構巢曲霉PKS的表達并產生化合物arugosins；采用同樣的策略誘導海洋真菌Ascotrichasp.中三萜類合成酶基因的強烈表達并合成3,4-裂環羊毛脂烷三萜[22]。張疏雨等[23]發現紅汁乳菇的最佳生長碳源為葡萄糖和麥芽糖，最佳氮源為蛋白胨和酵母膏，而本研究與其存在差異，即肌醇和山梨醇為誘導紅汁乳菇Lhpks1基因表達的最佳碳源，番茄浸粉為最佳誘導表達氮源。原因可能為張疏雨等[23]在研究紅汁乳菇生長碳源分析中未采用肌醇、山梨醇和番茄浸粉，還有可能是因為能強烈誘導LhPKS1基因表達的培養基配方與最佳生長培養基不同。因此，本研究有助于通過改變培養基成分誘導LhPKS1基因的表達，并為通過表達或異源表達生產苔色酸類化合物及其骨架提供參考。