茶多酚對人脂肪來源間充質干細胞成骨分化的影響

王 華，齊玉成，楊云芳，趙藝洋，王 慧，陳 培，楊旭芳

(1.牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.南方醫科大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510515)

隨著人口老齡化，骨質疏松癥已成為影響人們生活質量的主要因素之一[1]。目前臨床普遍采用經典的抗骨吸收和促骨形成藥物，但對于因機體衰老導致的骨質疏松，療效欠佳，此外上述藥物還存在成本高昂等問題?；谏鲜鲈?，尋找一種高效、經濟的藥物已迫在眉睫。同時，臨床上組織工程骨較自體骨移植治療骨缺損修復方面具有明顯優勢，但如何獲得豐富的種子細胞一直是構建組織工程骨所要解決的重要問題。有研究報道綠茶提取物茶多酚(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)對骨髓間充質干細胞的成骨分化有影響，但結論不一[2]，關于EGCG對hADSCs成骨分化影響的研究僅見一篇[3]。故本研究以獲取容易且具有高度增殖能力的hADSCs為研究對象，探討EGCG對hADSCs成骨分化的影響。以期為骨質疏松癥的治療開發新的藥物，并未為組織工程骨的研究提供豐富安全的種子細胞。

1 材料與方法

1.1 材料脂肪組織來源于附屬紅旗醫院外科。低糖DMEM(Hyclone,USA)，10%胎牛血清(Hyclone,USA)，0.25%胰酶(Invitrogen)，膠原酶Ⅰ(Invitrogen)，抗CD44、CD73及CD105單克隆抗體(BioLegend,USA)，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑(碧云天，上海)，EGCG(Sigma,USA)，青霉素、鏈霉素(Sigma,USA)。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs的分離與培養 外科獲得的脂肪組織，用滅菌PBS液反復沖洗，仔細分離去除血管及結締組織，最后剪成1 mm3大小的碎塊。用0.1%Ⅰ型膠原酶37 ℃消化60 min，200目篩網過濾，獲得的細胞用條件培養基[4](LG-DMEM、10%FBS、100 μg/mL streptomycin、100 units/mL penicillin)重懸，37 ℃、5% CO2的孵箱內培養，2 d后首次換液，以后每3 d更換一次培養基，待細胞融合至80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡觀察不同代次hADSCs的形態特點，后續實驗均采用P3代hADSCs。

1.2.2 流式細胞儀檢測hADSCs表面標志 0.25%胰酶消化收集P3、P6及P9代細胞，每例樣本細胞數為2×105個左右；細胞重懸于1mL 0.01 M PBS中洗滌2次，1500 r/min，10 min；棄去PBS，與一抗孵育液(一抗稀釋度為1∶100)常溫下孵育30 min；0.01 M PBS洗滌2次后，分別與FITC標記的二抗(稀釋度為1：50)4 ℃避光孵育30 min；0.01 M PBS洗滌2次后，棄去PBS，再加入300 μL 0.01 M PBS重懸細胞，用于流式細胞儀分析。

1.2.3 hADSCs成骨分化 消化收集細胞，調整細胞密度為1×105/mL,接種于24孔板，實驗分三組，即未誘導組、常規成骨誘導組及EGCG+常規成骨誘導組(簡稱EGCG組)，24 h后常規成骨誘導組換為成骨誘導基礎培養液(含200 μmol/L維生素C、7 mmol/L β-甘油磷酸鈉和0.1 mmol/L地塞米松的DMEM細胞培養液)，EGCG組更換為含5 μmol/L EGCG、200 μmol/L維生素C、7 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和0.1 mmol/L地塞米松的DMEM細胞培養液，每3 d更換培養液1次，分別于誘導2周后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態學并照相，然后用0.1 mol/L PBS洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，進行堿性磷酸酶(ALP)染色(細胞爬片，10%甲醛固定，堿性磷酸酶孵育液37 ℃孵育3 h，硝酸鈷作用5 min，硫化銨處理1 民，常規脫水透明，封片)，以鑒定成骨細胞。

1.3 統計學分析采用SPSS 25.0，計數資料以百分率(%)表示，采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 誘導前后hADSCs的形態學特點倒置顯微鏡下可見：未誘導hADSCs形態均一，長梭形，呈現成纖維細胞樣，當細胞融合至80%左右時，表現為魚群樣或漩渦樣生長。成骨誘導2周后，部分細胞由長梭形變成多角形，細胞呈現聚集趨勢(見圖1)。

圖1 誘導前后hADSCs的形態學特點(×100)

2.2 hADSCs表面標志利用流式細胞術分別檢測P3、P6及P9代hADSCs的免疫學標志，結果顯示各代hADSCs CD44、CD73及CD105陽性率高達93%以上，不同代次間表達無統計學差異(見圖2)。

2.3 hADSCs成骨分化未誘導組hADSCs ALP染色胞漿呈現為淡灰色，ALP活性為陰性；hADSCs常規成骨誘導組于誘導2周后ALP染色，細胞胞漿呈現灰黑色，ALP活性為陽性；EGCG組ALP染色，可見胞漿為深黑色，ALP活性呈強陽性(見圖3)。

圖2 流式細胞術動態檢測hADSCs表面標志

圖3 hADSCs成骨分化后ALP染色(×100)

3 討論

hADSCs是近年來生物醫學研究中頗具吸引力的多潛能細胞。主要位于脂肪組織的基質血管部分(SVF)中[5]。hADSCs比其它間充質干細胞(MSCs)具有更顯著的優勢，首先因為它易于提取，在局部麻醉下就可進行，同時對患者造成的損傷更小。其次，很容易從已收獲的組織中分離出目標干細胞[6-7]。更重要的是脂肪來源的干細胞具有高度的增殖能力，并且數量要遠高于骨髓來源的干細胞[8]，體外培養的不同代次hADSCs能夠穩定表達間充質干細胞的表面標志。

EGCG是綠茶中最具生物活性的兒茶素之一，已被證實其在體內外均可促進骨形成[9]。多項臨床研究表明，飲茶對骨骼有積極的影響。飲茶者有更好的骨密度和更低的髖部骨折率[10]。Nash等學者的研究表明經常喝茶的人椎骨密度比不喝茶的人高[11]。一項與骨質疏松性骨折相關的5年前瞻性試驗的橫向分析也表明，與非飲茶者相比，飲茶者的骨密度損失率較低[12]。

然而，研究者對于EGCG在促干細胞增殖及成骨分化中的影響存有一些爭議。有研究[13]提出，1μmol/L的EGCG就能抑制小鼠間充質干細胞D1細胞系增殖。這種差異可能是實驗使用的細胞來源不同導致。Kamon等[14]提出EGCG通過劑量依賴性的方式，抑制了小鼠成骨細胞前體細胞(MC3T3--E1)的成骨分化；而Sakai等[15]則認為EGCG明顯增強了前列腺素-2α介導的骨保護素合成，從而促進了干細胞的成骨分化。但MC3T3-E1的分化潛能較弱，因此并不能以此否定了EGCG對干細胞成骨分化的正向作用。

禁食條件下，飲用一杯綠茶可使EGCG在血液循環中的濃度達到1 μmol/L[16]，口服1.6 gEGCG可使其在人血漿中達到7.6 μmol/L的濃度。本實驗中，EGCG促進hBMSCs成骨分化的有效濃度為5 μmol/L，因此在日常飲茶中很容易達到有效濃度。

本實驗結果表明EGCG在5 μmol/L時能增強hADSCs的成骨分化，因此EGCG在hADSCs骨組織工程中具有潛在的應用價值。但EGCG在促hADSCs成骨分化方面的具體機制我們尚不了解，后續實驗我們將進一步探討其促成骨分化的分子機制。