野菊花抗菌活性的網絡藥理學研究

代書景，劉 洋，桂金秋，李福娟，王小花，唐小云，石學魁

(牡丹江醫學院 1.病原生物學教研室；2.病原生物學與免疫學實驗室，黑龍江 牡丹江 157011)

網絡藥理學是將基因組學、拓撲學、計算組學等多學科、多技術結合起來，試圖通過構建疾病-基因-靶點-藥物相互作用的網絡模型來探索潛在中藥藥理活性、作用機制和毒性活性的有力工具[1]。網絡藥理學作為新興學科之一，在闡明其綜合作用機制方面具有傳統方法無法比擬的優勢[2],并且它已成功地應用于中醫藥相關的研究領域，以闡明其治療機制。

野菊花為菊科植物野菊(ChrysanthemumindicumL)的干燥頭狀花序，為中國藥典收錄的藥用植物，性味苦、辛、微寒，歸肝、心經，其功能為清熱解毒、瀉火平肝，臨床應用較廣，多用于治療疔瘡癰腫、目赤腫痛和頭痛眩暈[3]。已有研究表明野菊花含有揮發油、黃酮類和萜類等多種化學活性成分，具有抗炎[4]、抗菌[5]、鎮痛[6]、抗氧化活性[7]、肝保護作用[8]等。野菊花應用廣泛，被稱為中草藥中的“廣譜抗生素”[9]。但目前對野菊花的活性作用機制研究甚少，本研究通過網絡藥理學方法構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，分析野菊花抗菌作用的活性成分及相應作用靶點，探討其可能的抗菌作用機制。

1 資料與方法

1.1 野菊花有效成分篩選及靶點的預測利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[10]檢索野菊花的所有化學成分，根據口服生物利用度(OB≥30%)以及化合物類藥性(DL≥0.18)篩選野菊花的有效成分，并利用TCMSP獲取其有效成分對應靶點，通過Perl(版本5.30.0.1)腳本利用uniprot數據庫對靶基因進行注釋。

1.2 抗菌相關基因靶點的預測以“antibacterial”作為檢索詞輸入GeneCards網站(https://www.genecards.org/)，檢索抗菌的相關基因靶點。

1.3 野菊花“藥物-成分-靶點-疾病”可視化網絡的構建應用R包(VennDiagram包)將抗菌基因靶點與野菊花基因靶點取交集，用Cytoscape3.7.2軟件，構建野菊花“藥物-成分-靶點-疾病”網絡。

1.4 野菊花抗菌的蛋白互作網絡的構建、核心基因篩選將野菊花有效成分的抗菌靶點導入STRING數據庫(http://string-db.org/)，設置物種為“Homo sapiens”，其余參數保持默認設置，構建蛋白互作網絡(Protein-protein interaction network，PPI)，并篩選核心基因。

1.5 基因富集分析對關鍵靶點進行基因本體(GO)富集分析和KEGG 通路富集分析，以探討野菊花有效成分抗菌靶點蛋白在基因功能及信號通路中的作用。

1.6 統計學方法使用R語言軟件(3.6.1)調用Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)對數據進行處理，設置PvalueCutoff=0.05、QvalueCutoff=0.05為顯著性差異限定值。

2 結果

2.1 野菊花有效成分及靶點的篩選結果在TCMSP中，以OB和DL作為篩選條件，共得到化合物成分12個，對應的靶點283個。利用uniprot數據庫對靶基因進行注釋得到活性成分7個(表1)，相應靶點163個。

2.2 抗菌相關基因靶點的預測結果通過Genecards 網站檢索到抗菌相關基因766個，選擇Relevance score大于1的抗菌基因為271個。

2.3 野菊花“藥物-成分-靶點-疾病”網絡的構建結果應用R包對抗菌基因靶點與野菊花有效成分基因靶點取交集，得到野菊花-抗菌共同靶點19個(圖1)。

應用Cytoscape 3.7.2軟件，將19個野菊花-抗菌共同靶點構建“藥物-成分-靶點-疾病”的網絡模型(圖2)。結果顯示，野菊花的4種有效成分協同作用于19個抗菌靶點，其中槲皮素擁有最多的對應靶點，達17個；木樨草素、刺槐素、β-谷甾醇分別含有6、3、2個靶點。說明槲皮素可能在抗菌作用過程中起到關鍵作用。這反映了野菊花抗菌活性的多靶點、多成分的特點。

圖1 抗菌相關靶點與野菊花有效成分作用靶點的韋恩圖

2.4 PPI網絡構建、核心基因篩選結果在STRING 數據庫構建19個共有靶點的PPI網絡(圖3)，剔除1個游離靶點蛋白KCNH2，共18 個靶點參與了PPI網絡，85條連線代表了蛋白之間相互作用，線條越粗表示作用越強?；蚺c鄰接基因連線的數目越多，其是網絡調控核心基因的可能性越高，說明在網絡中的作用越大，很可能是野菊花藥效發揮的關鍵靶點(圖4)。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果利用R 語言的clusterProfiler 工具包[11]，將基因symbol轉為基因ID，并對獲取的基因進行GO 富集分析，以校正的P<0.05進行篩選，獲取21個GO條目，對排名靠前的10個條目繪制氣泡圖(圖5)。結果顯示，抗菌靶點主要富集在細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、受體調節活性、CXCR趨化因子受體結合、抗氧化活性等方面。

圖4 野菊花抗菌活性的關鍵靶點

KEGG 通路富集分析，根據校正的P<0.05篩選出71條信號通路，排名前20的通路信息見表2，取前10個通路繪制氣泡圖(圖6)。結果顯示，野菊花抗菌靶點主要富集于甲型流感病毒(Influenza A)、Toll樣受體信號通路(Toll like receptor signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、南美錐蟲病(Chagas disease)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、弓形蟲病(Toxoplasmosis)等信號通路，這提示野菊花有效成分可能通過多條信號通路發揮抗菌作用。

圖5 GO功能富集分析氣泡圖

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

表2 KEGG富集分析潛在相關通路靶點

3 討論

傳統中藥與單一化合物成分比較具有一定的優勢，能夠通過多成分、多靶點、多通路發揮作用，這就需要從整體性和系統性方面研究中藥的作用機制，因此，以大數據生物信息學為基礎的網絡藥理學等方法的提出，對闡明中藥及其有效成分、靶點、通路之間的相互作用及作用機制具有重要意義[12-13]。

野菊花單用或者與其他藥物聯合具有抑菌活性[14-15]，但其作用機制研究較少。本研究通過網絡藥理學方法篩選了7個野菊花的有效活性成分，預測了271個潛在相關抗菌基因靶點。通過構建“藥物-成分-靶點-疾病”的可視化網絡圖，發現野菊花抗菌活性具有多靶點、多成分的特點。野菊花抗菌的有效成分包括刺槐(acacetin)、木犀草素(luteolin)、槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)，其中前三種為黃酮類化合物，β-谷甾醇為萜類化合物。這4種化合物協同作用于19個抗菌靶點，其中槲皮素擁有17個靶點，木樨草素有6個、刺槐素有3個、β-谷甾醇有2個靶點，與以往文獻報道相一致，野菊花黃酮類化合物和萜類化合物具有顯著的抗菌作用[16-17]。這表明野菊花能夠通過4個有效成分作用于多個靶點發揮抗菌作用。

從PPI網絡分析的結果來看，IL-1β、CXCL8、IL-10、ICAM1、IFNγ、CASP3等因子與炎癥、趨化、黏附、凋亡等有關，可能是是野菊花抗菌的核心靶點。其中，IL-1β是重要的炎癥因子，參與炎癥相關性疾病的發生發展，范曉輝等[18]通過血清學檢測發現布氏菌病陽性血清中IL-1β水平升高，表明布氏菌感染能夠使機體過度產生IL-1β從而導致病情發展。易玲等[19]發現給宮頸炎模型大鼠外用野菊花總黃酮可減少炎癥的發生，顯著降低血清IL-1β和TNF-α水平。而IL-10是抑炎因子，能夠抑制炎癥反應，李東陽等[20]發現白頭翁煎劑可使實驗性大腸濕熱型潰瘍性結腸炎模型大鼠炎癥反應減輕或消除，與抑制炎癥因子IL-17A的釋放、增加抑炎因子IL-10的分泌有關。CXCL8是CXC趨化因子配體8(cysteine X chemokine ligand 8)，可由炎癥因子TNF-α和IL-1β等誘導產生，在活動性肺結核患者中表達水平升高[21]。CASP3(Caspase3)是caspase級聯激活下游的關鍵成分，是誘導細胞凋亡的蛋白酶,執行細胞凋亡過程[22]。由此推測，這些靶點是野菊花有效成分等作用靶點。

為了研究野菊花有效成分抗菌靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究將19個抗菌靶點進行GO功能富集和KEGG通路富集分析。GO分析結果顯示，野菊花有效成分主要富集在細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、受體調節活性等方面；而KEGG信號通路分析發現與野菊花抗菌作用密切相關的通路有71條，主要包括甲型流感病毒通路、IL-17信號通路、南美錐蟲病通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、弓形蟲病等信號通路。IL-17信號通路準確度最高(P=7.40×10-10)，是野菊花主要抗菌途徑。IL-17是炎性細胞因子，其調控的下游靶基因功能廣泛，主要涉及細胞凋亡、胞外菌免疫、炎癥反應、宿主防御、自身免疫等，有文獻報道[23]IL-17在肺炎支原體感染所引起的免疫紊亂和炎癥反應機制中發揮著重要作用。本研究發現野菊花能夠作用于IL-17信號通路上的靶點CASP3、NFκBIA、IFNγ、IL-1β、CXCL8、CXCL10、CHUK，說明野菊花可以通過調控IL-17信號通路發揮抗菌作用。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)可調控IL-1β的生成，使IL-1β前體經過一系列過程形成有活性的IL-1β發揮炎癥反應[24]。TNF信號通路中的TNF-α與特異性受體結合，可以激活多條信號通路，調控細胞凋亡或存活、誘發炎癥反應等作用。黃勇等[25]發現野菊花提取物可降低慢性支氣管炎大鼠體內TNF-α含量，減輕炎癥效應，而本研究富集在TNF信號通路的結論與其是相吻合的。由此推測，野菊花可通過多條信號通路發揮抗菌作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法探討野菊花抗菌作用的有效成分、相關靶點及相關信號通路，為進一步研究野菊花抗菌活性的作用機制提供了一定的理論基礎，為野菊花的進一步開發應用提供科學依據。