乙肝肝硬化腸道菌群變化與肝功能Child-Pugh分級、LPS及血氨的相關性

張良杰，李 偉，陳家盛，劉傳苗，趙守松

(蚌埠醫學院第一附屬醫院感染科，安徽 蚌埠 233000)

肝硬化是我國常見的慢性進行性肝病，最主要病因是乙型肝炎病毒感染，可導致肝功能損害、內毒素血癥、消化道出血、腹水、肝性腦病等，并成為患者預后的重要影響因素[1]。近年來關于乙肝肝硬化機制的研究較多，已明確內毒素(LPS)可引起肝臟炎癥反應，促進肝纖維化增生，加重肝硬化[2]；血氨在肝硬化患者中水平高于正常人群，其與肝硬化患者肝功能損害程度有關[3-4]。但長期臨床工作經驗發現，LPS、血氨無明顯異常的乙肝患者，仍會發生肝功能損害與肝硬化，提示有其他機制參與了肝功能的惡化。腸道菌群是定植于人體最大的微生態系統，正常情況下腸黏膜有很多益生菌，共同維持內環境穩態，并參與機體免疫功能的調節[5-6]。研究發現，乙肝肝硬化患者與正常人群相比，存在腸道菌群變化，但與乙肝患者腸道菌群對比的報道較少，且腸道菌群變化是否與肝功能、LPS及血氨有關仍有待探討[7]。鑒于這種情況，本研究選取乙肝肝硬化及單純乙肝患者作為研究對象，探討乙肝肝硬化腸道菌群變化與肝功能Child-Pugh分級、LPS及血氨之間的相關性，為深入了解肝硬化發生機制、肝硬化及其并發癥的防治提供參考，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月至2020年1月間，蚌埠醫學院第一附屬醫院感染科收治的80例乙肝肝硬化患者(肝硬化組)、80例單純乙肝患者(乙肝組)及體檢中心80例健康人群(對照組)。納入標準：乙肝組及肝硬化組病例分別符合我國《慢性乙型肝炎防治指南2019年版》及《肝硬化診治指南》診斷標準[8-9]；入組前3個月未接受過微生態制劑和抗生素治療。排除標準：合并乙肝病毒外其他嗜肝病毒感染者；藥物性肝炎者；酒精性肝炎者；自身免疫性肝炎者；遺傳代謝性肝病等慢性肝臟疾??；存在肝癌等惡性腫瘤者；精神病患者；胃腸道大手術史；炎癥性腸病患者。該項研究征得研究對象的知情同意，并通過了我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集患者的性別、年齡、身體質量指數(Body mass index，BMI)、飲酒史、合并疾病、近期用藥史等資料。

1.2.2 腸道菌群、LPS、血氨檢測 (1)腸道菌群檢測：在患者入院后，收集新鮮糞便標本，0.5 h內送檢，挑取中心部位糞便樣本進行檢測，或留取新鮮糞便標本保存條件為-80 ℃冰箱凍存，擇期統一檢測。使用QIAamp DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取糞便DNA，嚴格按照說明書進行操作，以提取的DNA為模板，使用帶Barcode的特異引物，338F(5’-GTACTCCTAC GGGAGGCAGCA-3’)和806R(5’-GTGGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3’)與高效高保真酶(新西蘭Biolabs公司)進行PCR反應，應用測序儀(美國Pacific Biosciences)進行測序，應用Uparse軟件進行聚類分析，采用Mothur方法進行物種注釋，采用Version 2.15.3 R軟件進行多樣性分析，記錄腸道各菌群的拷貝數、衡量菌群豐度的Chao指數、衡量群落多樣性的Shannon指數。(2)在患者入院后次日采集清晨外周靜脈血5 mL，采用鱟試劑比濁法試劑盒檢測(廈門市鱟試劑實驗廠)血漿LPS水平，采用血氨測定儀(日本京都AMMONIA測定儀(日本京都Ⅱ型)檢測血氨水平，為避免血氨檢測時間帶來的誤差，血氨檢測均于采集血標本后立刻送檢。

1.2.3 肝功能Child-Pugh分級 包括臨床生化指標、HE、腹水、總膽紅素、白蛋白、凝血酶原時間延長，A級：5～6分,B級：7～9分,C級：≥10分。HE的診斷參考《肝硬化肝性腦病診療指南》[10]。

1.3 觀察指標(1)對比三組臨床資料，包括患者的年齡、性別、BMI、飲酒史和合并以下疾病情況，高脂血癥、糖尿病、心臟病、高血壓。(2)比較三組腸道菌群變化。(3)比較三組研究對象腸道菌群豐度和多樣性Chao指數、Shannon指數、LPS、血氨有無統計學差異。(4)分析腸道菌群豐度和多樣性Chao指數、Shannon指數與肝功能Child-Pugh分級、LPS、血氨相關性。(5)在肝硬化組內比較有無HE患者腸道菌群豐度和多樣性Chao指數、Shannon指數、LPS、血氨指標的差異。(6)分析腸道菌群豐度和多樣性、LPS、血氨診斷HE的效能。

1.4 統計學方法采用SPSS 25.0處理數據，計數資料以頻數和構成比n(%)表示，行卡方檢驗，計量資料采取Bartlett方差齊性檢驗與Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗，均確認具備方差齊性且近似服從正態布，以“均數±標準差”表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。采用Pearson相關分析腸道菌群豐度和多樣性與LPS、血氨相關性；采用Spearman秩相關分析肝功能Child-Pugh分級與腸道菌群豐度和多樣性相關性。采用ROC及AUC獲取各指標診斷HE的置信區間、敏感度、特異度及cut-off值，聯合診斷實施二元logistic回歸擬合，返回預測概率logit(P)，將其作為獨立檢驗變量，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料比較三組年齡20～68歲，肝硬化組平均年齡為(40.04±9.95)歲，乙肝組平均年齡為(39.51±9.68)歲，對照組平均年齡(38.97±9.42)歲，三組年齡無顯著性差異。肝硬化組、乙肝組、對照組BMI分別為(22.37±2.16)、(22.43±2.07)和(22.34±2.13)，三組BMI差異無統計學意義。組間性別、飲酒史、合并疾病等資料均衡，具有可比性(P>0.05)，見表1。

表1 三組臨床資料對比[n(%)]

2.2 三組腸道菌群變化比較乙肝組、對照組擬桿菌門、厚壁菌門是腸道菌群的絕對優勢菌，在腸道菌群中占比之和>80%，乙肝組、對照組組間擬桿菌門、厚壁菌門占比比較，差異無統計學意義(P>0.05)。肝硬化組擬桿菌門、厚壁菌門占比低于乙肝組、對照組(P<0.05)。變形菌門、梭桿菌門占比：肝硬化組>乙肝組>對照組(P<0.05)。放線菌門、疣微菌門、藍菌門在肝硬化組、乙肝組及對照組間無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 三組腸道菌群變化比較

2.3 三組腸道菌群豐度和多樣性、LPS、血氨比較Chao指數、LPS：肝硬化組<乙肝組<對照組，Shannon指數、血氨：肝硬化組<乙肝組、對照組(P<0.05)。Shannon指數、血氨在乙肝組、對照組間無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 三組腸道菌群豐度和多樣性、LPS、血氨比較

2.4 腸道菌群豐度和多樣性與肝功能Child-Pugh分級、LPS、血氨相關性肝硬化組Child-Pugh分級A級30例、B級32例、C級18例。Chao指數與Child-Pugh分級(r=-0.594，P<0.001)、LPS(r=-0.694，P<0.001)、血氨(r=-0.606，P<0.001)呈負相關，Shannon指數與Child-Pugh分級(r=-0.529，P<0.001)、LPS(r=-0.663，P<0.001)、血氨(r=-0.850，P<0.001)呈負相關，見圖1。

圖1 腸道菌群豐度和多樣性與肝功能Child-Pugh分級、LPS、血氨相關性

2.5 肝硬化組有無HE患者腸道菌群豐度和多樣性、LPS、血氨比較肝硬化組患者根據有無HE分為HE患者和無HE患者，HE患者Chao指數、Shannon指數低于無HE患者，LPS、血氨高于無HE患者(P<0.05)，見表4。

表4 癌組織P-ERK1/2蛋白磷酸化與臨床病理相關性

2.6 腸道菌群豐度和多樣性、LPS、血氨診斷HE的效能各指標聯合診斷HE的AUC最高，為0.891，其次是血氨(0.825)，見表5、圖2。

表5 ROC分析結果

3 討論

3.1 乙肝肝硬化腸道菌群變化本研究發現，變形菌門、梭桿菌門占比：肝硬化組>乙肝組>對照組，Chao指數肝硬化組<乙肝組<對照組，Shannon指數肝硬化組<乙肝組、對照組，提示乙肝和肝硬化均可引起腸道菌群變化，而單純乙肝患者腸道菌群的絕對優勢菌占比與正常人群相似，進展至肝硬化后，絕對優勢菌占比明顯降低，說明肝硬化導致腸道菌群變化更明顯，隨著病情加重，腸道菌群豐度和多樣性均降低。有動物學實驗顯示，隨著肝硬化的進展，模型大鼠與正常大鼠腸道菌群相似性明顯降低，細菌易位率明顯升高，佐證了肝硬化可造成腸道菌群的變化[11]。張磊等[12]報道，肝硬化患者厚壁菌門、擬桿菌門比例顯著降低，本研究觀點與之相似。乙肝肝硬化患者肝臟功能損傷后，可通過腸-肝軸，降低腸道的血供、減少膽汁分泌、影響腸道蠕動等，引起腸黏膜功能變化，且肝功能嚴重受損時，可介導腸黏膜氧化應激反應，減弱腸黏膜屏障功能，增加腸黏膜通透性，從而導致腸道菌群變化[13-14]。

圖2 腸道菌群豐度和多樣性、LPS、血氨診斷HE的效能

3.2 乙肝肝硬化腸道菌群變化與肝功能Child-Pugh分級、LPS的關系肝功能Child-Pugh分級是臨床上常用的評估肝臟儲備功能的指標，與乙肝肝硬化患者預后息息相關[15]。本研究顯示，Chao指數、Shannon指數與Child-Pugh分級呈負相關，提示腸道菌群豐度和多樣性可影響乙肝肝硬化患者肝功能。人類肝臟中3/4的血供來源于腸道的回流血，門靜脈和腸系膜淋巴系統在解剖上的關聯，使肝臟與腸道菌群在功能上存在密切聯系，一方面腸道中食物抗原、細菌產物、環境毒素等能通過血液，運輸至肝臟，破壞肝臟結構，導致肝功能受損，另一方面肝硬化患者因發生門脈高壓，增加了腸黏膜通透性，結腸菌群、LPS等可通過腸壁淋巴系統與腸黏膜屏障，引起內毒素血癥、細菌易位、腹膜炎等，導致肝硬化的惡化，故腸道菌群變化可影響患者肝功能分級[16-17]。乙肝肝硬化患者隨著肝功能減退和門靜脈高壓加重，發生內毒素血癥的風險逐漸增加，LPS不僅在促進肝纖維化中扮演重要角色，還與感染、肝腹水、HE等有關，因此明確內毒素血癥發生機制至關重要[18]。本研究顯示，Chao指數、Shannon指數與LPS呈負相關，說明腸道菌群豐度和多樣性與LPS有關。LPS是革蘭陰性菌細胞壁組成成分，可反映細菌生長情況，高水平LPS可導致腸源性內毒素血癥的發生，因此腸道菌群異?？赡苁莾榷舅匮Y發生的一個機制?？梢娕R床處理乙肝肝硬化患者時，除常規治療外，還應重視腸道菌群的糾正，本研究結果為益生菌干預提供了有力依據。

3.3 乙肝肝硬化腸道菌群變化與血氨的關系及各指標診斷HE的價值機體氨來源于蛋白質的消化和谷氨酰胺的脫氨基過程，氨在腸道產生后，先進入門靜脈[19]。若機體肝功能正常，可清除幾乎所有腸道來源的氨，避免其進入外周循環，損害機體，因此血氨可反映機體肝功能狀態[20-21]。本研究數據顯示，Chao指數、Shannon指數與血氨呈負相關，說明腸道菌群可影響血氨水平，其機制可能是通過影響肝功能及蛋白質的消化實現的。HE是乙肝肝硬化患者常見的一種并發癥和死因[22]。目前臨床診斷HE多依據臨床表現、肝功能生化指標、HE誘因病史、腦電圖等進行綜合診斷，診斷方法復雜，且易漏診輕型HE?，F階段關于腸道菌群、LPS、血氨聯合診斷HE的報道鮮見，本研究對此探討發現，HE患者Chao指數、Shannon指數低于無HE患者，LPS、血氨高于無HE患者，提示以上參數可能與HE有關。因此后續進行了ROC分析，結果顯示單一指標中血氨AUC最高，能為臨床選取合適指標診斷HE提供參考，但仍低于各指標聯合AUC的0.891，說明各指標聯合能為臨床提供更可靠的參考信息，從而指導臨床后續的相關檢查與干預。本研究不足之處在于，通過腸道菌群分析獲得Chao指數、Shannon指數需進行多項操作，基層醫院可能無法實施，導致研究結果應用范圍縮小，有待后續的進一步探討。

綜上所述，乙肝肝硬化腸道菌群異常與肝功能Child-Pugh分級、LPS、血氨有關，腸道菌群可能參與了肝功能惡化、內毒素血癥以及HE并發癥的發生與病情進展，腸道菌群Chao指數、Shannon指數有助于HE的診斷，調節腸道菌群有望成為乙肝肝硬化患者治療方案中的一部分。