Wnt/β-catenin信號通路抑制劑在肝細胞癌中的研究

裴志燕，張嶺漪

蘭州大學第二臨床醫學院肝病科，甘肅 蘭州 730000

肝癌是全球第六大常見癌癥，也是僅次于肺癌、結直腸癌、胃癌的第四大癌癥致死原因[1]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發性肝癌的75%～85%[2]，其中72%發生在亞洲，中國占50%以上[1]。HCC的發生與慢性肝病密切相關，由于危險因素的流行程度不同，HCC在全球范圍內的發病率是不均勻的，非洲和東亞地區為高發地區，這些地區的患者多有乙型肝炎病毒(HBV)和黃曲霉毒素B(Aflatoxin B)暴露史[1]。

近年來，HCC發病率的不斷上升促使人類對其細胞、遺傳和分子機制進行深入研究，以期開發出更有效的治療方法。最近的基因組學研究準確地描述了HCC發生、發展的基因變化情況，并確定了最常見分子生物學通路，其中Wnt/β-catenin信號通路的異常激活促進了HCC的發生、發展[3-5]；且該通路的激活可導致上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的發生，增強HCC的侵襲能力[6]。約95%的HCC存在Wnt/β-catenin信號通路的失調，并呈現β-catenin核聚集現象[7]。已證實Wnt/β-catenin信號通路中關鍵基因的突變在HCC的發生、發展中起著重要作用[8]。在HCC中，編碼β-catenin蛋白的CTNNB1基因突變率為15%～37%[9]，Axin1和Axin2失活突變率分別為10.4%和3.3%，結腸腺瘤性息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)突變率約為1.4%[10]。此外，最新研究顯示，β-catenin核聚集現象僅限于晚期HCC，在早期階段，β-catenin主要位于多個鈣黏連蛋白家族蛋白成員的質膜上，通過增強生長因子受體(EGFR)的信號傳導促進腫瘤細胞的存活[11]。這充分揭示了β-catenin在HCC早期已經發揮促癌功能，并強調了β-catenin在HCC進展過程中具有復雜的作用。

1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-catenin信號通路是高度保守且在生物學功能的調節過程中發揮著不可或缺的作用[5，12]。經典Wnt信號通路(β-catenin-dependent)傳導的關鍵是細胞質和細胞核中β-catenin的水平。Wnt配體在內質網(ER)中通過?；D移酶(Wnt acyl-transferase porcupine，PORCN)的棕櫚?；揎椇筢尫?，在細胞膜上通過自分泌或旁分泌的方式發出信號[10]。在通路激活狀態下，Wnt配體與跨膜卷曲受體(Frizzled，FZD)和低密度脂蛋白受體相關蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein-5/6，LRP5/6)在細胞膜上結合，促進由Axin-GSK3-CK1α-APC構成的破壞復合物(destruction complex)的降解，使β-catenin不能被磷酸化-泛素-蛋白酶體途徑降解[7]。非磷酸化的β-catenin在胞質中逐漸積累并入核，與T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)形成轉錄復合物，并招募共激活因子(BCL9、CBP/P300)啟動下游靶基因(c-Myc、cyclin D1、survivin)的表達[13](見圖1A)。相反，在Wnt配體缺失時，破壞復合物對β-catenin進行磷酸化修飾，經泛素-蛋白酶體途徑對其進行降解，抑制下游信號通路的傳導[14](見圖1B)。此外，不依賴β-catenin的信號通路(β-catenin-independent)也可啟動下游信號，主要包括平面細胞極性信號通路(the planar cell polarity signaling pathway)、鈣依賴性信號通路(calcium-dependent signaling pathway)和GTP酶依賴性信號通路(small-GTPase-dependent signaling pathway)[15]。

圖1 Wnt/β-catenin信號通路

2 Wnt/β-catenin信號通路的調節

Wnt/β-catenin信號通路在干細胞中處于激活狀態，而在正常組織中處于抑制狀態，主要是通過Wnt配體和β-catenin破壞復合物的平衡調節[16]。SFRP(secreted frizzled-related protein，SFRP)、Dikkopfs(DKKs)和Wnt抑制因子(WIF)，以及與LRP6結合的Kallistatin通過抑制配體受體的結合，對Wnt/β-catenin信號通路具有負調節作用[17-18]。此外，胞質中的β-catenin受到破壞復合物的嚴格調控，破壞復合物主要由Axin-GSK3-CK1α-APC構成，其中Axin和APC主要起穩定破壞復合物的作用，促進β-catenin的磷酸化及蛋白酶體降解，起到抑制信號通路的作用[16，19]。

3 Wnt/β-catenin信號通路抑制劑在HCC中的應用

諸多研究證實，Wnt/β-catenin信號通路在HCC的發生、發展中具有重要的生物學功能，這極大地促進了對該通路抑制劑的深入探究。近年來，針對各種腫瘤類型研發有效的Wnt/β-catenin信號通路抑制劑取得了巨大進展，表1概括了目前對HCC有效的Wnt/β-catenin信號通路抑制劑?，F分別對阻斷受體與配體結合、穩定破壞復合物、干擾β-catenin轉錄因子三類抑制劑進行闡述。

3.1 配體/受體抑制劑

3.1.1 OMP-54F28、sFZD7和Salinomycin：FZD蛋白由7個跨膜結構域和1個胞外N端富含半胱氨酸結構域(CRD)構成，在信號傳導過程中，FZD和單通道跨膜分子LRP5/6同時與Wnt配體結合，激活Wnt/β-catenin通路的下游信號[20]。OMP-54F28(Ipafricept)作為誘餌受體，可與Wnt配體結合，阻斷Wnt/β-catenin信號通路的傳導[21]。OMP-54F28聯合索拉非尼治療晚期HCC患者的臨床試驗(NCT02069145)進一步評估了其安全性及耐受性。在一項基礎研究中，FZD7的胞外結構域蛋白(sFZD7)可明顯減少HCC細胞系中β-catenin/TCF4的轉錄活動。在體外，sFZD7劑量依賴性地降低了三種HCC細胞系(HepG2、Hep40和Huh7)的存活率，但對三種供體的正常肝細胞幾乎無影響[22]。此外，sFZD7與阿霉素聯合使用，在體內、外研究中均顯著增強了阿霉素對HCC細胞的生長抑制作用，蛋白免疫印跡實驗進一步驗證了下游蛋白的表達水平明顯下降[23]。Salinomycin主要作為抗生素應用于臨床，研究證明其不僅可以下調HCC中具有干細胞特性的CD133+細胞亞群的比例，還可降低晚期HCC患者對5-氟尿嘧啶(5-FU)的耐藥性，增強5-FU的抗瘤效果[24-25]。

表1 HCC中具有抗瘤作用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑Tab 1 Wnt/β-catenin signal pathway inhibitors which have anti-tumor effect in HCC

3.1.2 Anti-Wnt1、WIF-Fc/SFRP-Fc和IWP12：Wnt-1配體在HCC細胞系和HCC組織中的高表達，且與HCC患者的預后不良相關[26]。研究證明，anti-Wnt-1抗體降低HCC細胞(Huh7、Hep40)增殖和存活能力，但并不影響Wnt-1低表達的正常肝細胞[27]。此外，anti-Wnt-1抗體不僅可以減少β-catenin/TCF4的轉錄活動，而且可以抑制Huh7異種移植瘤模型中腫瘤的生長；Wnt-1是HCC細胞的生存因子，阻斷Wnt-1介導的信號通路可能為治療過表達Wnt-1的HCC亞群提供一種潛在的特異性治療策略[26]。在另一項研究[28]中，在HCC細胞中表達融合蛋白WIF1-Fc和sFRP1-Fc，可下調E2F1、c-Myc、cyclinD1的表達，促進HCC細胞的凋亡。進一步研究證明，WIF1-Fc和sFRP1-Fc均能顯著抑制人微血管內皮細胞和小鼠內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的成管和遷移。研究數據表明，Wnt拮抗劑WIF1-Fc和sFRP1-Fc通過增加腫瘤細胞的凋亡和抑制腫瘤新生血管的形成，抑制Wnt/β-catenin信號通路，發揮強大的抗腫瘤活性。

3.2 β-catenin破壞復合物抑制劑(XAV-939和WXL-8)端錨聚合酶(Tankyrase，TNKS)促進Axin-GSK3-CK1α-APC復合物中Axin的降解，從而導致胞質及細胞核中β-catenin水平升高[29]。XAV-939和WXL-8可抑制TNKS活性，降低下游β-catenin水平，抑制通路的過度激活。通過RT-PCR發現HCC組織中TNKS1/2 的mRNA水平較癌旁組織明顯升高，在HCC細胞系(Huh7、Hep40)中，XAV939和WXL-8明顯抑制HCC細胞增殖和集落形成，降低胞質與細胞核的β-catenin水平。在HCC異種移植動物體內注射XAV939或WXL-8可明顯抑制皮下異種移植瘤的生長(P<0.05)[30]。這提示TNKS是Wnt/β-catenin依賴性HCC的潛在治療靶點。

3.3 干擾β-catenin轉錄復合物抑制劑

3.3.1 PKF118-310、PKF115-584和CGP049090：Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵蛋白β-catenin入核后可與TCF、CBP等轉錄因子結合，共同啟動下游靶基因的表達，促進癌細胞的增殖與遷移[13]。PKF118-310、PKF115-584和CGP049090可以選擇性地干擾β-catenin和TCF4的結合。在一項基礎研究[31]中，這三種化學物質在體外對三種HCC細胞系(HepG2、Hep40和Huh7)均表現出明顯細胞毒性，且呈劑量依賴性；但其對正常肝細胞的毒性較HCC細胞低10倍。在HepG2和Huh7細胞中，三種化合物降低TCF4/β-catenin的結合能力和轉錄活性，并下調c-Myc、cyclinD1和survivin等下游靶基因的表達。此外，三種化合物可誘導HepG2和Huh7細胞凋亡和細胞G1/S期阻滯。在HepG2移植瘤模型中，所有的拮抗劑均抑制了腫瘤的生長，并與細胞凋亡和c-Myc、cyclinD1、survivin的表達降低有關。研究結果表明，PKF118-310、PKF115-584和CGP049090可特異性的干擾TCF4/β-catenin轉錄活性，為HCC的臨床治療提供新的選擇。

3.3.2 聚乙二醇干擾素α(pegylated-interferon-α，Peg-IFN)：Peg-IFN是HBV和丙型肝炎病毒(HCV)患者的一線治療藥物，臨床研究已證實其可降低患者遠期并發癥HCC的發生率[32]。研究[33]證明，使用Peg-IFN處理HCC細胞，可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲能力。在體外，Peg-IFN通過降低HCC細胞中β-catenin/TCF的轉錄活性，并誘導DKKs和RanBP3(Ran binding protein 3，RanBP3)等負性調節因子的表達；在體內，Peg-IFN亦可降低細胞核β-catenin和cyclinD1的水平。Peg-IFN在體、內外均顯示了其通過抑制Wnt/β-catenin信號通路降低HCC細胞增殖和侵襲能力。Peg-IFN的藥代動力學特征與安全性已在長期的臨床應用中得到證實，其降低肝炎患者的HCC發生率可能與其早期干預Wnt/β-catenin信號通路有關。

4 展望

越來越多的證據表明，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活在HCC的發生、發展中起重要作用。靶向Wnt/β-catenin信號通路為HCC的治療開辟了一條新的途徑，該領域眾多的小分子抑制劑和生物制劑的開發將為HCC的治療提供新的思路。此外，苦參堿等天然化合物可通過調控Wnt/β-catenin信號通路削弱HCC的惡性程度，這為HCC的防治提供了更多的選擇[34]。然而，針對Wnt/β-catenin信號通路的小分子抑制劑在HCC治療中的應用仍未獲得突破性進展，深入的研究有助于設計更有效的治療策略，推動具有特殊分子特征HCC新療法的進程。