Immuno-PET在程序性細胞死亡受體配體-1活體成像中的研究進展

肖慶澳，夏 旋

三峽大學醫學院生理與病理生理系，湖北 宜昌443002

免疫正電子發射型斷層掃描儀（Immuno-PET）是一種將單克隆抗體（Mab）靶向特異性與PET技術高度敏感性融為一體的新型分子成像技術。這種技術不僅能識別與量化腫瘤細胞的靶點表達、了解全身免疫細胞的數量與分布、分子生物標志物的改變以及炎癥反應進程［1］，還可對體內免疫藥物的分布與代謝進行動態分析［2-3］。作為腫瘤標志物，程序性細胞死亡受體配體（PD-L1）是當前腫瘤免疫治療的熱點，各種單克隆抗體（如納武單抗、派姆單抗、Avelumab）開始應用到臨床［4-6］。越來越多的研究顯示PD-L1的體內表達水平會影響免疫療法療效，因此了解PD-L1體內表達對免疫治療方案的制定具有重要意義。傳統“活檢方式+免疫組化”不能對其表達進行實時動態評估，因此需要一種高特異性和靈敏度的方法對其表達進行定位、定量分析。本文就近年來Immuno-PET在活體表征腫瘤中PD-L1的研究進展作一綜述。

1 Immuno-PET簡介

自上世紀70年代PET進入臨床應用以來，經過30多年的發展其在臨床成像與診斷上的應用已非常廣泛。20世紀80年代開始，相應臨床研究表明使用放射性標記的Mab可以對腫瘤進行分子成像。但隨著18F-脫氧葡萄糖正電子發射斷層顯像（18F-FDG PET）的應用，有限的診斷準確率使得抗體分子成像使用受限。雖然當時仍有少數研究人員嘗試將其應用于特異性顯像并取得了一些成就，但受制于當時探測器和處理軟件的限制，并沒有得到廣泛的應用［8］。近10年來，得益于免疫靶點研究的深入，多種抗體（如：抗細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4、抗PD-L1 和抗PD-1）研發為Immuno-PET的廣泛使用奠定了基礎，同時晶體探測器、掃描系統、抗體工程技術和核素合成技術的發展，也使得利用示蹤劑抗體進行放射標記成像逐漸成為主流［8-9］。

Immuno-PET 作為一種新技術，其原理在于：將Mab用正電子核素（如68Ga、89Zr、124I等）標記并通過靜脈入血，由血液循環將Mab帶到腫瘤組織并與表面抗原相結合，或者提前注入特異性Mab，再注射被核素標記的能識別Mab的小分子使正電子核素在特定器官或組織中蓄積；利用放射性同位素不穩定易放出正電子的特性，通過晶體探測器可檢測出同位素正電子與組織負電子堙滅過程中產生的粒子（如γ射線粒子）；由于正電子在組織中穿行距離僅僅只有幾毫米，并受組織密度和初始能量影響，因此PET掃描系統掃描到粒子后，通過計算飛行時間就可以精確定位體內腫瘤的產生部位；在獲得大量基本數據后通過計算機系統進行圖像重建可得出患者的PET圖像［7,10］。

2 Immuno-PET活體表征PD-L1的應用價值

PD-L1與細胞程序性死亡受體（PD-1）結合會抑制活化的T細胞，抑制免疫系統的抗腫瘤功能。通過抑制PD-1/PD-L1通路可解除對抗腫瘤T細胞的抑制，從而達到治療腫瘤的目的［11］。研究顯示PD-L1存在于各種類型的腫瘤組織中，包括黑色素瘤、多發性骨髓瘤、白血病、膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌等［11］。此外，PD-L1的高表達也與腫瘤患者的不良預后密切相關。因此測定腫瘤細胞PD-L1表達水平可作為免疫治療的評價標準。研究顯示，對PD-L1陽性腫瘤患者使用藥物抑制PD-1/PD-L1通路后，有效率可達90%以上［12-13］。值得注意的是，約10%免疫組化PD-L1 陰性患者對于PD-1/PD-L1通路治療反應良好［14-15］。這可能是PD-L1的腫瘤異質性與抽樣誤差所致。

傳統“活檢方式+免疫組化”受制于PD-L1動態表達與異質性，不能及時準確表現體內分布狀況；此外，活檢取樣只能得到一個病變的組織樣本，不一定真實反映多個腫瘤或患者的免疫狀態。PD-L1的表達也會隨著疾病發展、免疫治療、放化療的進行而改變。通過多次活檢了解體內PD-L1的動態變化也并不現實［2］。此外，據美國食品藥品監督管理局報告顯示，使用不同抗體與檢測方法所得出的免疫組化結果之間也存在差異［16］。相比于免疫組化，使用核素標記PD-L1抗體進行PET成像更具優勢［17-19］，既避免多次活檢所造成的損傷，也能精確動態反映體內PD-L1的表達狀況。對于原發性與轉移性腫瘤均可通過非侵襲的方式進行相應評估。

在免疫藥物靶向治療方面，現有技術（如質譜分析、細胞熱位移測定、熒光各向異性成像）有助于表征藥物在細胞與組織中的活性，但在實時量化多病灶與跨病灶的藥物靶點應用有限［20］。而Immuno-PET卻可以提供一種精確方法來量化多病灶中存在的藥物靶點，解決目前面臨的一些挑戰［21］，同時其還可評估治療期間不同劑量與預后時間對腫瘤表征PD-L1的影響，通過數學建模分析治療抗體的有效劑量［20］。在評估免疫療法預后效果方面，現有方法如18F-FDG PET雖也可預測與評估靶向治療方案，但其部分參數（如最大標準攝取值SUVmax、平均標準攝取值SUVmean）與免疫治療的臨床效果之間并不一致［22-23］。對比18F-FDG PET（通過檢測脫氧核糖代謝而了解腫瘤分布），Immuno-PET可直接通過監測靶向特定受體來提供腫瘤的生物標志物信息［24］。其對腫瘤的高度敏感性、高空間分辨率以及精確定量的能力可對臨床治療與組織攝取程度的關聯進行精確評估［25-27］。

3 常用表征PD-L1正電子核素

目前PD-L1顯像劑所用放射性核素主要有64Cu、68Ga、89Zr、124I。124I雖然也是選項之一，但其能量過大，在PET成像時會導致空間分辨率下降。其半衰期與新型放射性核素相比也過長（T?=4.2 d），同時其在體內的脫鹵作用也使得其應用受限［28］。89Zr（T?=78.4 h）因其易制備、成本低與純度高的特點自被應用之日起就受到廣泛關注，在臨床上具有廣闊的應用前景。雖然Zr+在體內對骨組織具有高親和力，可能會對各種骨骼疾病診斷帶來干擾，但其復合物在骨組織的蓄積呈現低而穩定的狀態，為其衍生復合物應用于成像提供了可能［29］。89Zr也易被生物細胞攝取，與傳統抗體（如西妥昔單抗）結合后在某些癌癥活體成像上表現較好［27］。此外，64Cu的化學配位研究已經基本成熟，許多高效螯合劑（如3p-CNE3TA、3p-C-NOTA與3p-C-DE4TA）被已被研發［30］。利用雙螯合劑（如3p-C-NOTA）與64Cu形成的新化合物具有適宜半衰期與組織低排斥性的特點。這顯示出64Cu在Immuno-PET應用中巨大的應用前景。近年來，隨著單域抗體這類短半衰期的抗體與新型合成技術出現，18F的高正電子產率與短半衰期也使其逐漸應用于Immuno-PET相關研究中［17］。除此之外，68Ga、111In等正電子核素也逐漸在PD-L1 的追蹤檢測中發揮著重要作用［31］。

4 新型PD-L1示蹤劑

在目前的實驗中，示蹤劑大多需要2～4 d獲得高組織對比度的PET圖像。這將會極大影響免疫治療方案的制定。因此，如何獲得更加高效的PD-L1探頭也是Mab優化研究的熱點之一（表1）?；贗mmuno-PET顯像原理，新型示蹤劑必須在溫和條件下高效、快速、特異性結合相應靶點，同時必須高特異性腫瘤攝取與低背景噪聲。示蹤劑需要盡可能快的達到特異性飽和，而未結合示蹤劑需迅速從血液循環中清除［1］。目前常見Immuno-PET示蹤劑類型包括IgG全長依賴型、Fab片段型、單域抗體、單鏈抗體與其它類型［1］。

4.1 全長IgG依賴型示蹤劑

目前IgG制劑的相關研究最為廣泛，其在腫瘤靶向治療上具有重要意義。有學者開發出一種新型抗PDL1的IgG稱為C4并利用去鐵氧胺B（DFO）螯合劑將89Zr與C4連接成89Zr-C4［29］。在注入抗PD-1反應陽性的人源腫瘤組織來源移植瘤模型48 h后，89Zr-C4在腫瘤中的蓄積達到高峰且遠高于血液與肌肉。這表明PD-1反應陽性患者可使用放射示蹤劑對體內PD-L1成像。但IgG分子量（150 000）大于腎濾過最大分子量（60 000），無法通過腎臟排出因而易產生蓄積。此外，其Fc段與新生兒Fc受體相互作用也使其在血清中難以快速清除，這也導致最佳背景噪聲比出現的時間點較長［1,7］。因此在使用前需要對其背景噪聲進行相應研究。有學者利用89Zr制備不同IgG抗體示蹤劑（如89Zr-antiCD20、89Zr-anti-EGFR）并結合Immuno-PET對抗體在人體非靶點表達組織內的非特異性蓄積與解離進行了量化并提供了基準曲線，為后續的相關研究提供了可能［32］；另有研究利用DIBO-DFO將抗PD-L1抗體與89Zr螯合生成89Zr-DFO-6E11，在對HCC827細胞與淋巴組織的顯像中取得較好效果［33］。

表1 幾種新型表征PD-L1的immuno-PET示蹤劑性質Tab.1 Properties of several novel PD-L1tracers of immuno-PET(Mean±SD)

許多IgG抗體免疫治療藥物也開發出相應的顯像劑［6］。Jagoda 等［34］使用89Zr 標記Avelumab（89Zr-DFOPD-L1 Mab）對PD-L1陽性人乳腺癌細胞（MDA-MB-231）移植小鼠模型進行PET成像［34］。值得注意的是，該研究顯示注射純89Zr-DFO-PD-L1 Mab（2 μg）時，小鼠骨組織對89Zr-DFO-PD-L1 Mab攝取高于腫瘤組織，若混合40 μg 的PD-L1 Mab 則可顯著增加腫瘤組織攝入89Zr-DFO-PD-L1 Mab；此外，Lesniak等［35］使用NSG小鼠（敲除Rag2 和IL-2Rγ，存在免疫缺陷）構建高表達PD-L1中國倉鼠卵巢細胞（CHO-hPD-L1）腫瘤模型，隨后注射[64Cu]Atezolizumab進行成像。注射后24 h與48 h 腫瘤每克組織注射劑量百分比（%ID/g）分別為39.8±2.8與40.6±6.9，而同一時間點對照組（CHO）的%ID/g為11.1±1.9與10.1±3.3。此外，對照組與實驗組小鼠其他器官和組織中的[64Cu]Atezolizumab無差異。這顯示出[64Cu]Atezolizumab在表征活體PD-L1的特異性。此外，有研究通過89Zr-Atezolizumab對患有轉移性膀胱癌、非小細胞肺癌以及三陰性乳房癌患者體內的PD-L1水平進行評估［36］。給予患者0.1～0.3 mg/kg劑量的89Zr-Atezolizumab便可用于PET成像，而這一劑量為推薦治療劑量的1/100［36-37］。在進行免疫治療后，相比于免疫組化與RNA測序預測標志物，患者免疫治療的效果與Immuno-PET表征PD-L1結果相關性更好。遺憾的是，因為89Zr-Atezolizumab的清除率較低，最佳PET圖像需要在數日后獲得。

4.2 Fab片段示蹤劑

與完整的抗體相比，抗體片段雖然潛在接合位點少［24］。但去除Fc部分可以降低顯影劑的免疫原性，從而在生物體內的半衰期更短且在腫瘤實質中分布更加均勻。Fab在聯合64Cu后也可以降低注射早期信背比［19,38］?；贔ab片段的PET顯像劑非特異性累積少、清除更快，可提供更高的對比度成像［39］。有學者開發出一種新型Fab片段（αPD-L1），其利用1，4，7-三氮雜環壬烷N，N'，N''-三乙酸（NOTA）將αPD-L1與64Cu結合進而形成64Cu-NOTA-αPD-L1［40］。64Cu-NOTA-αPD-L1注入裸鼠靜脈45 min后可獲得最佳圖像并發現棕色脂肪組織和脾臟呈現富集狀態。而在注入64Cu-NOTA-αPDL1前，使用αPD-L1的Fab（200 μg）進行抑制處理后棕色脂肪組織與脾中NOTA螯合劑的富集情況消失，顯示出64Cu-NOTA-αPD-L1在PET成像劑中的特異性與可靠性。

4.3 單域抗體示蹤劑

單域抗體又稱納米抗體，是來源于駱駝與鯊魚血清中的最小抗體綁定衍生物（15 000）［41］。其只包含抗體重鏈，體積只有正?？贵w的1/10，具有非常適宜的物理化學性質，一直以來都被當做一種潛在的優質顯像劑。有學者利用單域抗體與68Ga結合形成的68Ga-NOTANb109復合物進行成像實驗，在A375-hPD-L1細胞組織中表現出高親和力，而且這種親和力不會隨競爭性抑制劑（如KN035）的增加而減弱，提示該單域抗體的結合位點與PD-1不同［42］。68Ga-NOTA-Nb109的體內半衰期為47.79 min，在注射2 h后，90%以上的復合物都經過尿液以原型排除，腎臟對抗體的蓄積保持在較低狀態，血管與肌肉中復合物含量也都顯著下降。相較于IgG，單域抗體表現出強大的易排除特點。此外，KN035是我國自主研發的一種抗PD-L1單域抗體Fc融合蛋白，其采用IgG的Fc段融合單域抗體，從而獲得對人PD-L1的高敏感性與特異性，對鼠PD-L1無交叉反應。Li等［16］基于KN035在肝臟具有較高的本底同位素攝取的特點，使用89Zr來降低本底信號。在對靈長類動物試驗中利用流式細胞儀驗證了其與89Zr結合生成的89Zr-Df-KN035對于A375細胞的高度敏感性，以高效液相色譜法對89Zr-Df-KN035的標記效率進行檢測發現標記效率超過70%。

4.4 高特異性肽段示蹤劑

WL12是一種由14個氨基酸組成的環狀肽，與PDL1 具有較高的親和力［43］。Chatterjee 等［44］將64Cu 與WL12螯合，形成[64Cu]WL12并注入到動物模型中，其PET圖像顯示hPD-L1腫瘤的腫瘤血液比（T/B）與腫瘤肌肉比（T/M）分別為25.6±1.9 與4.7±1.2，這與[64Cu]WL12 提供高信噪比的PD-L1 特異性圖像的能力一致。將[64Cu]WL12與過量WL12（50 μg）注入小鼠模型中顯示，注射2 h后對比小鼠PD-L1陽性腫瘤中放射性含量。相比于對照組，注射過量WL12的小鼠表達PDL1腫瘤組織放射性含量下降了75%。結合上述研究，有學者基于68Ga半衰期與WL12的藥物動力學性質相符，將68Ga 與WL12 結合形成新PD-L1 示蹤劑[68Ga]WL12，[68Ga]WL12在注射入小鼠后15 min即被攝取，在60 min 與120 min 時，T/B 值分別為7.56±16.47 與16.02±3.40［43］，這表明該種示蹤劑在血液中的留存時間較少，其最佳T/M比值也遠高于其他示蹤劑（表1），競爭性抑制試驗顯示高PD-L1腫瘤中示蹤劑含量明顯降低，表明[68Ga]WL12對于PD-L1具有高親和力。

5 總結與展望

Immuno-PET在腫瘤PD-L1表達的檢測與定量中發揮著重要作用。盡管目前動物實驗已經取得了進展，但用于人體診斷與治療評估的Immuno-PET還存在很多問題。不僅需要改進現有的示蹤標記物，而且還需要建立Immuno-PET 的臨床診斷標準。限制Immuno-PET臨床應用的因素有很多（如探頭合成、計算機系統算法更新），但主要限制因素在于缺乏臨床試驗。

基于目前Immuno-PET表征PD-L1的發展趨勢，期望在未來Immuno-PET在表征活體PD-L1上能有以下幾個方面創新：（1）從與PD-1結合位點不同的新靶點出發研制新型示蹤劑，以減少對免疫藥物治療的干擾；（2）嘗試開發PD-L1的單鏈抗體與Fab片段示蹤劑；（3）增加PET的敏感性與分辨率，以減少放射性顯像劑對患者造成的損傷；（4）依據核素的化學配位更有針對性的進行螯合劑研究從而獲取性質更加優良的PD-L1探頭；（5）嘗試Immuno-PET臨床實驗，從而為Immuno-PET的臨床應用提供參考依據；（6）嘗試建立患者Immuno-PET診斷的分級制度與臨床診斷標準。隨著新型示蹤劑的開發與臨床數據的不斷積累，預計在不久的將來Immuno-PET活體表征PD-L1將會在腫瘤分子成像與免疫治療方案的臨床應用中發揮越來越重要的作用。