中耳膽脂瘤中活性氧及磷酸化蛋白激酶的表達及相關性研究

劉東亮 馬秀嵐

中耳膽脂瘤是一種由過度增殖的角質化鱗狀上皮構成的囊性非腫瘤性病變，目前其發病機制仍存在爭議[1]，較為公認的是內陷袋學說，該學說認為中耳腔負壓引起鼓膜內陷并形成囊袋是膽脂瘤形成的始發因素[2～5]。負壓會造成鼓室內重要通氣結構(如鼓峽、咽鼓管上隱窩)狹窄而引起鼓室內缺氧[6]，而長期的缺氧可以引起一系列的氧化應激反應[7]，其產物約95%為活性氧(reactive oxygen species，ROS)。

正常細胞內的ROS保持在低水平狀態，現在認為低水平的ROS是維持細胞內穩態和正常生理功能的關鍵因子[8]；但在某些因素剌激下，如：缺氧、炎癥刺激、紫外線或電離福射等，ROS會過量產生，引起細胞過度增殖或者凋亡等[9]。ROS及其相關信號傳導通路上的蛋白在多種疾病甚至癌癥中均呈現出表達異常[10]，在ROS參與的各種生物信號通路中，磷酸肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)調節途徑與ROS的關系最為密切[11]，但在中耳膽脂瘤中卻鮮有相關研究。本研究擬通過免疫熒光技術及Western blot免疫印跡法檢測中耳膽脂瘤組織和正常皮膚中ROS及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,P-AKT)的表達，并分析它們之間的相關性，探討其在中耳膽脂瘤形成機制中所起的作用，旨在為中耳膽脂瘤的診斷、治療提供參考。

1 資料與方法

1.1中耳膽脂瘤標本及正常皮膚取材 收集2019年9～12月在中國醫科大學附屬盛京醫院耳鼻咽喉科手術治療的中耳膽脂瘤標本25例，其中，男19例，女6例；年齡15～69歲，平均41.33±25.67歲；左耳8例，右耳17例；病程2～31年，平均16.50±11.33年，術后均經病理診斷為中耳膽脂瘤。同時收集行耳廓腫物切除術患者安全切緣處正常皮膚或行鼓膜修補術中廢棄及不能使用的耳后正常皮膚碎塊15例作為對照組(術前已告知患者同意并簽署知情同意書)，其中，男8例，女7例；年齡21～60歲，平均35.80±20.21歲；左耳9例，右耳6例；病程1～26年，平均13.53±10.33年。

1.2研究方法

1.2.1免疫熒光技術檢測ROS表達 將中耳膽脂瘤及正常皮膚組織冰凍切片復溫，晾干水分，多聚甲醛固定10 min，待多聚甲醛完全干后于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(pH8.0)的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，低火10 min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min(修復液和修復強度根據組織來確定)，切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，甩干PBS，滴加BSA，封閉30 min。在切片上用ROS熒光探針-二氫乙啶(Dihydroethidium, DHE)染色，切片平放于濕盒內4 ℃孵育過夜(濕盒內加少量水防止抗體蒸發)，玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察采集圖像(CY3激發波長510～560，發射波長590 nm，發紅光)并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Me-dia Cybernetics, Inc., 美國)進行半定量分析。

ROS冰凍切片免疫熒光實驗結果判讀：因為ROS不是基因蛋白，只需用ROS熒光探針-二氫乙啶(Dihydroethidium, DHE)染色即可，無需加二抗，直接封片即可；在熒光顯微鏡下呈紅色。

1.2.2Western blot免疫印跡法檢測P-AKT蛋白的表達 ①提取蛋白：將100 mg組織標本置于1～2 ml勻漿器中，用剪刀(無菌)將組織盡量剪碎。加400 μl單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中，進行勻漿；之后置于冰上。5分鐘后再次碾碎置于冰上，重復幾次使組織盡量碾碎。裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至2 ml離心管中，然后在4 ℃下12 000 rpm左右離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并在-20℃保存。用時取出，直接溶解上樣。②電泳:依據目的蛋白的分子量，配制10%SDS-PAGE膠跑垂直電泳，根據蛋白濃度調整上樣量，保持每孔45 μg蛋白上樣，先采用電壓90 V，1小時濃縮樣品蛋白，再采用電壓120 V、100 min電泳分離樣品蛋白。③轉膜:電泳結束后，PVDF膜先后要在純甲醇里浸泡10 min，去離子水中浸泡20 min，接著將海綿、濾紙、凝膠和PVDF膜一起放在轉膜緩沖液中浸泡10 min，按照“海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿”的順序裝放好轉膜裝置(膜靠正電極一邊)，按恒壓100 V電轉移120 min到PVDF膜上。④封閉和一抗孵育:用5%脫脂奶粉(日常生活中的即可)常溫下封閉搖床1.5小時，PBS液洗膜3次，每次15 min，隨后加入按說明書要求稀釋的P-AKT和內參GAPDH抗體，于4 ℃孵育過夜。⑤二抗孵育:TBST液洗膜3次，每次15 min，加入二抗，室溫下搖床2小時。⑥顯影:TBST液洗膜3次，每次15 min，用ECL顯色液顯色，定影液終止顯色。⑦各實驗重復3次。

1.3統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件對數據進行統計學處理，計量資料比較用兩樣本t檢驗，運用Pearson檢驗進行P-AKT和ROS表達之間的相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1ROS在中耳膽脂瘤和正常皮膚中的表達 在熒光顯微鏡下，ROS在膽脂瘤和正常皮膚的細胞核著色，ROS在膽脂瘤中的熒光強度明顯強于其在正常皮膚的強度(圖1)，兩者的平均熒光值分別為112.41±14.61和15.23±1.97，可見膽脂瘤組的平均熒光值明顯高于正常皮膚組(t=3.24,P<0.01)。

2.2Western blot免疫印跡法檢測P-AKT在膽脂瘤和正常皮膚的表達 Western blot免疫印跡法顯示，P-AKT在中耳膽脂瘤組細胞中表達明顯高于正常皮膚組細胞中的表達(圖2)，兩者的相對灰度值分別為0.95±0.08和0.41±0.07，差異有統計學意義(t=2.04,P<0.05)。

2.3ROS和P-AKT在中耳膽脂瘤中表達的相關性 應用Pearson相關性分析，ROS和P-AKT在中耳膽脂瘤中的表達呈顯著正相關，相關系數r=0.508(P<0.01)。

3 討論

ROS廣泛存在于各種組織細胞中，當環境發生改變時，如：缺氧、炎性刺激等，細胞的線粒體便可產生過量的ROS[9]，而ROS過量會對組織的生物功能帶來一系列的改變。最近研究顯示，ROS具有促進調亡和促進增殖的雙重作用，在急性劇烈的氧化反應或者急性炎癥時，ROS可導致細胞調亡甚至壞死[12]；但隨著應激反應時間的延長，慢性氧化應激可促進細胞的生長。Isnaini等[13]通過研究乳腺癌細胞系MCF-7中的氧化劑和抗氧化劑特性及其與作用時間的關系發現，使用過氧化氨模擬氧化應激分別干預24 h和5天，結果發現24 h后氧化抑制劑通過ROS可抑制MCF-7細胞的生長，而5天后ROS則促進MCF-7細胞的生長。提示慢性氧化應激或慢性炎癥反應中，ROS逐漸趨于誘導細胞增殖、血管新生及腫瘤細胞轉移。

在中耳炎的氧化應激相關研究中，Gar?a等[14]發現通過血清氧化應激值可以評估慢性化膿性中耳炎的氧化應激程度；Guo等[15]通過芹菜素抑制氧化應激的實驗發現兒童急性化膿性中耳炎患者中，隨著ROS表達的減少，炎癥程度和骨質破壞的程度也隨之減輕。中耳膽脂瘤的發生發展是一個長期的過程，不屬于急性炎癥，而且其在明顯的缺氧環境中形成，加上之前ROS雙重作用的研究，結合本研究結果中ROS和P-AKT在膽脂瘤中表達均較正常皮膚高，推測ROS在中耳膽脂瘤形成過程中主要起到促進細胞增殖的作用。

磷酸化的AKT被認為是一種與細胞增殖密切相關的因子，本研究結果顯示在中耳膽脂瘤中ROS和P-AKT均過量表達，且呈顯著的正相關性，推測在中耳膽脂瘤的形成過程中，ROS通過AKT信號通路發揮了促進細胞增殖的作用。結合之前在其他組織細胞中ROS/AKT通路的研究[11]，和之前對于中耳膽脂瘤磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatese and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)的研究[16]，推測在鼓室乳突腔長期缺氧的情況下，上皮細胞產生了大量的ROS，這些ROS定位于細胞核，可滅活同在細胞核中的PTEN蛋白。PTEN主要作用是抑制3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(3,4,5-phosphatidyl inositol phospate，PIP3)的合成來活化PI3K，而PI3K負責磷酸化AKT[17]，這樣在中耳膽脂瘤形成過程中，細胞的PTEN明顯減少，PI3K失去抑制而增多，增多的PI3K磷酸化AKT,使P-AKT增多，這與本研究的結果一致。磷酸化的AKT才具有生物活性[18]，可以激活或抑制其下游的作用底物，達到促進細胞增殖的作用，如P-AKT可使Bad 的Ser136 發生磷酸化，使其失去抗凋亡作用，促進細胞增殖[19]；P-AKT導致FoxO 蛋白磷酸化，使得細胞增殖和凋亡之間的平衡被打破，促進細胞生長，導致腫瘤發生[20]等。

綜上所述，在中耳膽脂瘤的形成過程中，ROS表達明顯增多，通過減弱PTEN對PI3K/AKT通路的抑制，使細胞中P-AKT增多，從而起到促進細胞增殖的作用。