濟陰顆粒對高脂血癥大鼠胰腺組織TLR-4信號通路的影響

劉小虎,梁茂新，李國信，孟 莉，甘 雨，張 旭，喬菊久，丁春曉，宋 杰，吳 怡，趙 磊

高脂血癥為血脂水平過高，可引起動脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等，脂蛋白脂酶缺乏可因乳糜微粒栓子阻塞胰腺的毛細血管，引起局限性胰腺細胞壞死而導致胰腺炎的發生[1]。人體每天攝入過多飽和脂肪酸可引起血膽固醇增高，其中主要以低密度脂蛋白為主[2]。飽和脂肪酸可抑制低密度脂蛋白受體的活性，降低低密度脂蛋白與低密度脂蛋白受體的親和性。中醫認為高脂血癥是痰癥的一部分，痰濕內阻高脂血癥常見于肥胖之人[3]。濟陰顆粒是在古代用藥規律的基礎上結合現代臨床經驗篩取所得，由生地黃、淫羊藿、丹參、香附、黃柏組成，5味中藥皆有調脂作用[4]。本研究分析了濟陰顆粒對高脂血癥大鼠胰腺組織的影響，旨在為高脂血癥引起胰腺損傷的防治及其中藥新藥研發提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗藥物 濟陰顆粒(由生地黃、淫羊藿、香附、丹參和黃柏，按5∶4∶3∶3∶3比例組方而成)。生地黃顆粒(批號：183345)、淫羊藿顆粒(批號：18112331)、丹參顆粒(批號：19032831)、香附顆粒(批號：19051161)、黃柏顆粒(批號：19032251)。上述5種單味藥免煎顆粒劑均購于江陰天江藥業有限公司。阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，國藥準字：J20070060，10 mg/片，批號：X67405)。

1.2主要試劑 兔抗鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體(批號：08012887)、兔抗鼠κ基因結合核因子P65(NF-κB P65)抗體(批號：AE073025)、兔抗鼠Toll-4樣受體(toll-likereceptors 4, TLR-4)抗體(批號：04058100)均購于北京博奧森生物技術有限公司。非特異性染色阻斷劑(批號：1906205392b)、內源性過氧化物酶阻斷劑(批號：190625391h)、生物素標記的羊抗大鼠/兔IgG聚合物(批號：1906215396b)、鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(批號：1906215395c)、枸櫞酸緩沖鹽(批號：19032604)、DAB顯色試劑盒(批號：1907240031B)均購于福建邁新生物技術開發有限公司。丙硫氧嘧啶(批號：P436521)、吐溫-80(批號：P354672)、膽固醇(批號：P354464)、丙二醇(批號：P453641)、膽酸鈉(批號：P243652)均購于成都華夏化學試劑有限公司?？偢视腿?TG)測定試劑盒(雙試劑直接法)購于南京建成生物工程研究所；磷酸鹽(PBS)緩沖液(批號：20190327)購于北京Solarbio科技有限公司。切片石蠟(批號：20190802)購于上海華東石蠟有限公司。蘇木素染液(批號：718112)購于珠海貝索生物技術有限公司。伊紅染液(批號：718123)購于珠海貝索生物技術有限公司。中性樹膠(批號：20190809)購于中國上海標本模型廠。鹽酸-乙醇分化液(批號：190107)購于珠海貝索生物技術有限公司。二甲苯(AR級，批號：20190801)、無水乙醇(AR級，批號：20191017)均購于沈陽市新華試劑廠,乙醚(批號：10009318)購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3實驗動物 SPF級SD大鼠50只，雌性，體質量160～200 g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司;實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2015-0001,實驗動物使用許可證號：SYXK(遼)2019-0004。大鼠飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心，飼養條件：溫度20～25℃，濕度40%～50%，自由飲食飲水。水及飼料均經輻照消毒處理。

1.4主要實驗儀器 MultiskanFC酶標儀(德國Thermo公司)，BX53型光電顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)，JKDP2型電熱恒溫培養箱(廈門醫療電子儀器廠)，AUTOSTAINER480S型全自動免疫組化染色機(賽默飛世爾科技有限公司)，TP1020型自動脫水機、EG1150C型冷凍臺、切片機、G1150H型包埋機均購于德國Leica公司，YG-280KX型攤片機、YG-280KX型烤片機均購于陽光神琦醫用科技有限公司。

1.5實驗方法

1.5.1動物造模：所有大鼠均適應性喂養7 d，并按體質量隨機分為對照組、模型組、濟陰顆粒低劑量組(5.04 g/kg)、濟陰顆粒高劑量組(10.08 g/kg)、阿托伐他汀鈣組(1.80 mg/kg)，每組10只。除對照組外，其余4組大鼠每天給予脂肪乳劑(膽固醇10 g、豬油25 g、丙硫氧嘧啶1 g、吐溫-80 25 ml、1,2-丙二醇20 ml、膽酸鈉2 g、蒸餾水30 ml)[5]10 ml/(kg·d)灌胃造模。邊造模邊給藥，對照組和模型組給予蒸餾水10 ml/kg灌胃，其他3組分別給予相應藥物10 ml/kg灌胃，連續8周[6]。

1.5.2標本采集和檢測方法:5組大鼠末次給藥后均禁食、水12 h。乙醚麻醉，大鼠腹主動脈取血分離血清。紫外可見分光光度法檢測血清甘油三酯(TG)含量。取出胰腺福爾馬林固定，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察胰腺組織形態。免疫組化染色檢測NF-κB P65、TNF-α、TLR-4。

1.5.3HE染色方法：切片常規梯度脫蠟至水，蘇木素溶液染色，1%鹽酸乙醇分化，0.5%伊紅溶液染色，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。于400倍顯微鏡下觀察5組大鼠胰腺組織的病理改變，采集圖片。

1.5.4免疫組化染色方法：切片常規梯度脫蠟至水。滴加內源性過氧化物酶阻斷劑37℃孵育。于枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 7.0)中高壓修復。滴加血清封閉，滴加一抗(TNF-α 1∶200，NF-κB P65 1∶150，TLR-4 1∶200)，孵育。滴加生物素標記的羊抗大鼠/兔IgG聚合物,孵育。滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶,孵育。滴加DAB顯色劑。蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化，中性樹膠封片。于400倍顯微鏡下觀察各組大鼠胰腺組織蛋白表達情況，采集圖片。圖片使用Image J軟件進行分析，檢測圖片中各蛋白表達的灰度值[7]。根據灰度值計算光密度值(OD),OD=log[gv0/gv)]，圖片中蛋白表達為陰性區域的灰度值gv0，gv目標區灰度值。

2 結果

2.1大鼠血清TG含量比較 5組TG分別為：對照組(0.64±0.14)mmol/L、模型組(1.72±0.15)mmol/L、濟陰顆粒低劑量組(1.37±0.19)mmol/L、濟陰顆粒高劑量組(1.24±0.19)mmol/L、阿托伐他汀鈣組(1.14±0.17)mmol/L。與對照組比較，模型組血清TG含量顯著增加，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，濟陰顆粒低、高劑量組和阿托伐他汀鈣組血清TG含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

2.2大鼠胰腺組織病理形態學比較 與對照組比較，模型組大鼠胰腺組織有炎性細胞浸潤、水腫，腺泡萎縮，出現類似空泡樣結構。與模型組比較，濟陰顆粒低、高劑量組和阿托伐他汀鈣組胰腺組織病變明顯減輕，可見部分腺泡萎縮及少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 濟陰顆粒對高脂血癥模型大鼠胰腺組織的影響(HE×400)濟陰顆粒低、高劑量組大鼠分別給予濟陰顆粒5.04、10.08 g/kg

2.3大鼠胰腺組織TLR-4、NF-κB P65、TNF-α表達水平比較 與對照組比較，模型組胰腺組織TLR-4、NF-κB P65和TNF-α表達顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，濟陰顆粒低劑量組、高劑量組和阿托伐他汀鈣組TLR-4、NF-κB P65和TNF-α表達顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表1、圖2～4。

圖2 濟陰顆粒對高脂血癥模型大鼠胰腺組織TLR-4表達的結果(HE×400)濟陰顆粒低、高劑量組大鼠分別給予濟陰顆粒5.04、10.08 g/kg;TLR-4為Toll-4樣受體

表1 5組大鼠胰腺組織TLR-4、NF-κB P65和TNF-α表達比較

2.4大鼠血清TG含量與胰腺組織中TLR-4、NF-κB P65及TNF-α表達相關性分析 血清TG含量與胰腺組織TLR-4、NF-κB P65及TNF-α表達具有相關性(r=0.478、0.673、0.727，P<0.01)。

3 討論

急性胰腺炎為臨床中常見的急腹癥，病重時可出現全身炎癥反應和器官功能障礙，重癥急性胰腺炎病死率可高達30%[8]。急性胰腺炎病因主要有膽道疾病、酗酒、高脂飲食等，高脂血癥是急性胰腺炎的重要致病因素之一[9]。隨著人們飲食結構的改變,目前我國高脂血癥性急性胰腺炎發病比例逐年增加。血清TG水平越高，高脂血癥性急性胰腺炎發病概率越大，可能與游離脂肪酸的細胞毒作用、炎性介質-細胞因子損傷有關[10]。本研究結果顯示，與模型組比較,濟陰顆粒低、高劑量組血清TG含量及胰腺組織病變明顯減輕。說明濟陰顆?？梢酝ㄟ^降低血清TG水平，減輕高脂血癥引起胰腺損傷的作用。

圖3 濟陰顆粒對高脂血癥模型大鼠胰腺組織NF-κB P65表達的結果(HE×400)濟陰顆粒低、高劑量組大鼠分別給予濟陰顆粒5.04、10.08 g/kg;NF-κB P65為κ基因結合核因子P65

圖4 濟陰顆粒對高脂血癥模型大鼠胰腺組織TNF-α表達的結果(HE×400)濟陰顆粒低、高劑量組大鼠分別給予濟陰顆粒5.04、10.08 g/kg;TNF-α為腫瘤壞死因子-α

Toll樣受體為重要病原模式識別受體，可特異性識別病原體相關分子并與之結合，激活免疫炎癥反應[11]。TLRs是跨膜模式識別受體，通過受體胞外段的TLR結構域與病原體的“內源性危險信號”相結合；進而激活細胞內信號傳導通路，活化NF-κB啟動核內相關基因表達，促使IL-6、IL-1β及TNF-α等細胞因子合成與釋放，激活免疫細胞并產生炎癥反應[12]。

TLR-4分布在人類及大鼠的胰腺管上皮組織和內皮組織中，因此TLR-4觸發胰腺炎的炎癥反應時存在分子基礎。胰腺組織中TLR-4表達增加，提示炎癥反應加重[13-14]。急性胰腺炎的早期只有無菌性炎癥，TLR-4仍能激活巨噬細胞而釋放出大量炎性介質，因此TLR-4在急性胰腺炎的病情變化中起到重要的促炎作用[15]。

NF-κB是一種重要的轉錄調節因子，參與炎癥相關的基因表達；急性胰腺炎進展與TLR-4及其下游信號通路NF-κB密切相關，NF-κB可直接參與調控炎癥反應[16]。正常NF-κB以無活性的三聚體形式存在于細胞質中，當細胞受到TNF-α及內毒素等刺激時，NF-κB因與IκB發生解離而激活[17]；NF-κB活化后可使IL-6和TNF-α表達增加，NF-κB通路激活直接增加了胰腺炎的嚴重程度[18]。

本研究結果顯示，濟陰顆粒低、高劑量組可顯著降低TLR-4、NF-κB P65和TNF-α在高脂血癥模型大鼠胰腺組織中的表達，且TLR-4、NF-κB P65和TNF-α在胰腺組織的表達水平與血清中TG含量有相關性。說明濟陰顆?？梢酝ㄟ^調節TLR-4信號通路減輕損傷胰腺的作用，與其降低血清中TG含量密切相關。

綜上所述，濟陰顆?？赏ㄟ^調節TLR-4信號通路對高脂血癥誘導的大鼠胰腺組織損傷產生保護作用，且該作用與濟陰顆粒調節高脂血癥大鼠血清中TG含量的作用密切相關。