慢性乙型肝炎患者病毒載量、PD-L1與肝纖維化及肝組織炎癥活動度的相關性分析

劉 甜，張 偉，梁俊榮， 徐 娜，張 婧，魏娟寧

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是患者感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)后發生的持續感染，所導致的乙型肝炎慢性化的消化系統傳染性疾病[1-2]。乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(hepatitis B virus Deoxyribonucleic acid, HBV DNA)病毒載量是病毒復制、活動的標志，該病病情的進展、預后與HBV DNA之間有密切聯系[3-4]。相關研究指出，CHB患者的免疫功能異常，T淋巴細胞質量及數量上有缺陷，機體無法通過自身細胞免疫功能清除HBV病毒[5]。程序性死亡因子配體1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)可以誘導T細胞凋亡，參與T細胞活化的過程并可發揮正性調控的作用，PD-L1的表達與CHB患者病情進展有著顯著相關性[6]。為進一步了解HBV DNA、PD-L1及肝纖維化對CHB患者肝組織炎癥活動度的影響，本研究選取了本院收治的102例CHB患者，分別探討了乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)表達陽性患者及HBeAg表達陰性患者的病理學指標情況，為臨床治療CHB患者提供理論指導?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2018年4月—2019年4月本院收治的102例CHB患者的臨床資料。①納入標準：均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》中的診斷標準[7]；臨床資料完整；納入研究前未接受過抗病毒治療；年齡為21～78歲；對本研究知情并簽署同意書。②排除標準：合并甲型、丙型等其他類型的肝炎患者；長期嗜酒者；有長期特殊藥物服用史者；因精神障礙無法配合治療者。按照HBeAg表達不同分為HBeAg陽性組72例和HBeAg陰性組30例。HBeAg陽性組男39例，女33例；年齡21～75(43.85±3.54)歲。HBeAg陰性組男18例，女12例；年齡23～78(43.91±3.59)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1HBV DNA測定：采用美國ABI公司提供的ABI 5700型熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀測定3組患者的HBV DNA，試劑盒由廣州達安基因股份有限公司提供。檢測過程應嚴格按照說明書進行。

1.2.2生化指標檢測：2組均于入院次日清晨空腹抽取靜脈血10 ml，去肝素鋰抗凝，采用密度梯度法分離單個細胞核，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)等量稀釋，加入10 ml淋巴細胞分層液中，離心后吸取單個核細胞層，PBS洗滌3次后重懸，在流式細胞儀上測定PD-L1水平。操作過程嚴格按照說明書流程完成。

1.2.3病理組織檢查：采用1 s快速穿刺肝組織活檢術采集肝臟組織，長度為1.5～2.0 cm。采集到的標本使用4%甲醛溶液固定，經常規石蠟切片、脫水后，使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光學顯微鏡觀察分析，并依據《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[7]進行病理分級。整個實驗操作過程嚴格按照說明進行。

2 結果

2.1CHB患者肝組織病理活檢結果 102例CHB患者根據肝纖維化程度分級[8]分組：S1組21例，S2組52例，S3～S4組29例；根據炎癥活動度分組：G1組10例，G2組56例，G3～G4組36例。

2.2HBV DNA、PD-L1表達水平比較 HBeAg陽性組HBV DNA、PD-L1表達水平顯著高于HBeAg陰性組(P<0.01)。見表1。

表1 2組CHB患者HBV DNA、PD-L1表達水平比較

2.3HBeAg陰性組肝纖維化程度、炎癥活動度與HBV DNA及PD-L1表達比較 將HBeAg陰性組30例按照肝纖維化程度分為S1組6例，S2組15例，S3～S4組9例；3組間HBV DNA、PD-L1表達比較差異無統計學意義(F=0.030、0.001，P>0.05)。根據炎癥活動度將HBeAg陰性組分為G1組4例，G2組9例，G3～G4組17例。3組間HBV DNA、PD-L1表達比較差異無統計學意義(F=1.790、0.060，P>0.05)。見表2。

表2 HBeAg陰性的CHB患者肝纖維化程度、炎癥活動度與HBV DNA、PD-L1表達比較

2.4HBeAg陽性的CHB患者肝纖維化程度、炎癥活動度與HBV DNA、PD-L1表達比較 將HBeAg陽性組按照肝纖維化程度分為S1組15例，S2組37例，S3～S4組20例，3組HBV DNA、PD-L1表達水平比較差異有統計學意義(F=8.890、7.220，P<0.05)。根據炎癥活動度將HBeAg陽性組分為G1組6例，G2組47例，G3～G4組19例。3組HBV DNA、PD-L1表達水平比較有統計學意義(F=7.090、6.590，P<0.05)。見表3。

表3 HBeAg陽性CHB患者肝纖維化程度、炎癥活動度與HBV DNA、PD-L1表達比較

2.5不同HBeAg表達的CHB患者炎癥活動度分級、肝纖維化程度與HBV DNA、PD-L1相關性分析 HBeAg陽性CHB患者中，HBV DNA與炎癥活動度分級及肝纖維化程度均呈正相關(r=0.454、0.398，P<0.05)；PD-L1與炎癥活動度分級及肝纖維化程度也均呈正相關(r=0.428、0.356，P<0.05)。HBeAg陰性CHB患者HBV DNA、PD-L1與炎癥活動度分級、肝纖維化程度分級均無相關性(P>0.05)。見表4、表5。

表4 HBeAg表達陽性的CHB患者炎癥活動度分級、肝纖維化程度與HBV DNA、PD-L1相關性分析

表5 HBeAg表達陰性的CHB患者炎癥活動分級、肝纖維化程度與HBV DNA、PD-L1相關性

3 討論

既往研究認為，CHB患者體內細胞免疫功能低下，導致HBV在機體內不斷復制，使肝細胞免疫病理損傷，引發持續感染導致患者病情加重。細胞免疫應答過程中，輔助性調節性T細胞均可影響細胞毒性T細胞，使其細胞數目及功能產生變化[9-10]。PD-L1屬于CD28/CT-LA-4家族，是一種共刺激分子。既往研究報道，PD-L1為調節抗HBV特異性T細胞免疫的關鍵分子，其提供的正向信號與慢性HBV感染關系極為密切[11]。文獻報道，HBV DNA升高可作為反映HBV復制最敏感的檢測指標之一[12]。本研究結果顯示，HBeAg陽性組HBV DNA、PD-L1表達顯著高于HBeAg陰性組，進一步證實了CHB患者HBeAg表達與HBV DNA、PD-L1之間存在密切聯系。有學者研究報道，HBeAg表達水平與血清病毒載量及PD-L1水平變化具有一致性[13]。分析其原因為HBeAg是一種可溶性蛋白，現臨床多依據HBeAg水平了解病毒復制、傳染及患者病情進展情況，在部分CHB患者體內核心區啟動子出現變異，導致HBeAg無法合成，所以會出現陰性表達，因此HBeAg陰性無法證明HBV復制水平降低或HBV已經清除[14]。CHB是一種免疫介導性疾病，發病機制尚未明確，主要為肝細胞表面抗原與宿主的免疫應答損害肝臟細胞[15]。HBeAg作為免疫耐受因子，HBeAg表達陽性可使CHB患者機體處于免疫耐受狀態，可見HBV DNA與肝臟損害程度之間無明顯聯系。HBeAg陰性的CHB患者HBV DNA不高，但患者機體內水平未保持在平衡狀態，也會使病情發展，影響預后。趙明英和李春林[16]在相關研究中證實了這一觀點。

國內外有較多學者報道，CHB患者與HBV DNA、PD-L1、肝纖維化及肝組織炎癥活動度之間的關系，但結果尚未達成一致[17-18]。本研究考慮到CHB患者體內HBeAg表達水平存在差異，分別研究了HBeAg陽性及HBeAg陰性患者體內HBV DNA、PD-L1表達情況及肝纖維化程度、肝組織炎癥活動度。結果顯示不同肝纖維化程度及炎癥活動度的HBeAg陰性組CHB患者HBV DNA、PD-L1水平比較差異無統計學意義；不同肝纖維化程度及炎癥活動度程度的HBeAg陽性組CHB患者HBV DNA、PD-L1水平比較差異有統計學意義。與既往研究報道結果相似[19]。

本研究結果顯示，HBeAg陽性組CHB患者中，HBV DNA、PD-L1與炎癥活動度分級、肝纖維化程度呈正相關，可見HBV DNA及PD-L1水平越高，患者肝臟組織損傷程度越重；HBeAg陰性CHB患者中，HBV DNA、PD-L1與炎癥活動度分級、肝纖維化程度之間無顯著相關性，這一研究結果與Rao等[20]報道結果一致?？紤]為HBeAg陽性的CHB患者乙型肝炎病毒的復制水平提高，會加速肝臟的損害程度，引發肝癌、肝硬化等惡性疾病的發生[21-22]。這提示臨床醫師對于HBeAg表達陽性CHB患者在治療時，可通過給予患者抗病毒治療阻礙肝臟病變的進一步發展；同時可加強監測CHB患者的HBV DNA、PD-L1，了解患者病情變化，制定有效的治療方案，減少肝臟癌變的概率，以保證患者生命健康，延長生存期[23]。

綜上所述，本研究初步探討了HBV DNA、PD-L1表達與其肝纖維化及肝組織炎癥活動度的相關性，結果顯示HBeAg陽性的CHB患者高HBV DNA、PD-L1表達會加重肝臟損害，而HBeAg陰性的CHB患者上述指標之間無顯著相關性。但PD-L1在CHB患者中作用機制尚未明確，且本研究納入樣本量較少，CHB患者體內HBeAg陰性表達及HBeAg陽性表達中HBV DNA、PD-L1水平與肝臟損害之間的相關性仍有待擴大樣本量，延長研究時間進一步探討。