脂聯素水平降低對小鼠卵泡發育的影響

張偉鵬，周道靖，林澤鵬，戴雪娟，柯 亮，謝欣宇，陳志群，程麗憲（通訊作者）

（廈門醫學院機能與臨床轉化福建省高校重點實驗室 福建 廈門 361023）

脂聯素（adiponectin, APN）是由脂肪細胞分泌的一種重要脂肪因子，有趣的是血清脂聯素水平與肥胖呈現負相關關系。脂聯素除具有增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用[1]外，與生殖內分泌也息息相關。我國婦女的不孕癥發生可能是多方面因素的作用結果。卵源性不孕目前是輔助和非輔助生殖醫學界面臨的一大難題，其原因可能與原始卵泡激活和卵泡發育過程的信號調控異常會導致早發性卵巢功能不足、卵泡生長遲緩、卵母細胞質量下降、排卵障礙等卵源性不孕事件的發生有關。卵泡在發育的過程中主要受到下丘腦—垂體調控的激素和多種信號通路的作用[2-3]。脂聯素主要通過與兩種主要的受體AdipoR1和AdipoR2結合發揮多效作用，而且脂聯素與其受體在顆粒細胞、卵母細胞和卵泡膜細胞中均有表達[4-5]。研究顯示脂聯素可能影響卵巢的類固醇生成、卵泡發育和排卵，其基因表達的變化受到與卵泡發育相關激素的影響。而且在接受FSH治療的婦女，其血清脂聯素水平與體內獲得的卵母細胞數量呈正相關[6]。這些研究表明，脂聯素可能與卵泡的發育成熟和閉鎖有關。

事實上，在脂聯素調節卵巢功能的潛在作用研究中尚存在一定的分歧。例如通過體外培養的豬顆粒細胞，脂聯素可以通過激活MAPK-ERK1/2途徑，使卵泡發育和類固醇合成酶相關基因的表達增加[7]。相反，另一項研究認為在黃體生成素存在的情況下，脂聯素可以抑制體外牛卵泡膜細胞類固醇的生成[8]。因此，本次研究以脂聯素缺失小鼠為模型研究脂聯素水平降低對于卵巢卵泡發育成熟的影響，為臨床女性不孕提供新的致病基礎。

1.資料與方法

1.1 實驗動物

實驗中所有使用的小鼠均為雌性。脂聯素基因缺失小鼠由廣東工業大學的趙子建教授惠贈；清潔級C57BL/6小鼠購自福建吳氏動物實驗中心，于廈門大學動物實驗中心飼養繁殖。廈門醫學院醫學倫理委員會動物試驗倫理審批件（批件號：20190504001）。

1.2 實驗試劑

小鼠脂聯素血清ELISA試劑盒購自美國Millipore公司，蘇木素、伊紅購自珠海貝索公司，石蠟購自美國Sigma公司，石蠟塊切刀片購自德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠血清脂聯素水平鑒定 在2019年6月—2020年11月將健康繁育的20周齡雌性C57BL/6（WT），脂聯素缺失雜合（APN+/-）和脂聯素缺失純合（APN-/-）小鼠各組10只，摘眼球取血，并低溫分離血清，于-80℃保存樣本。對于不同基因型小鼠血清中脂聯素的濃度的測定，利用小鼠脂聯素ELISA試劑盒說明書上的方法進行。

1.3.2 雌性小鼠生育率評估 健康繁育的8周齡WT,APN+/-和APN-/-雌鼠每種基因型各8只，與健康可育的C57BL/6雄性小鼠交配28周。并記錄28周期間每只雌鼠總產仔數。

1.3.3 卵巢蘇木精-伊紅（HE）染色和連續切片

卵巢固定于4%中性福爾馬林中過夜，常規石蠟包埋，于切片機上行厚為5μm的連續切片。間隔10張切片，取一張做HE染色，顯微鏡下計數每個卵巢所有HE切片中的原始卵泡、初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡和閉鎖卵泡的數量。卵泡總數包括原始卵泡、初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡和閉鎖卵泡[9]。計算方式為：各級卵泡所占比例=各級卵泡數目/卵泡數目×100%，上述所有卵泡類型均以卵泡總數的百分比表示。

1.4 統計學方法

運用GraphPadPrism 5.0統計分析，計量資料以表示，組間行t檢驗。計數資料以n%表示，組間行χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 脂聯素缺失小鼠血清脂聯素水平降低

利用小鼠血清脂聯素ELISA試劑盒分別檢測三組小鼠血清脂聯素的水平。結果發現WT小鼠血清脂聯素水平為（13.37±1.358）ng/mL, APN+/-小鼠血清脂聯素濃度（5.481±0.7063）ng/mL約為WT小鼠的50%，而APN-/-小鼠血清中則無法檢測到脂聯素（圖1）。

圖1 三組小鼠血清脂聯素水平檢測（***P＜0.001）

2.2 脂聯素缺失純合雌鼠的生育能力受損

8周齡的三組雌鼠各10只，分別與12周齡C57/BL6雄鼠按照1：1的比例交配，周期為28周，統計28周內各組雌鼠所生小仔數目。結果發現，APN-/-雌鼠所生仔數平均為18.2土3.3只，與WT雌鼠（30.5土3.7只）相比產仔數明顯減少，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。雖然APN+/-雌鼠平均所生仔數與WT相比，差異沒有統計學意義，但是數目卻有減少的趨勢，見表1。

表1 各組雌鼠生育力比較（ ± s，只）

表1 各組雌鼠生育力比較（ ± s，只）

與WT相比，*P＜0.05

組別 只數 產仔數WT 10 30.5±3.7 APN+/- 10 23.5±2.1 APN-/- 10 18.2±3.3*

2.3 脂聯素缺失小鼠卵泡發育異常

對不同基因型小鼠卵巢各級卵泡發育情況的分析結果顯示，WT小鼠卵巢各階段卵泡卵母細胞均清晰可見，其外具有完整的透明帶和排列規則的顆粒細胞。然而APN-/-小鼠的閉鎖卵泡顯著增加，腔前和腔卵泡數量顯著減少。具體為：APN-/-小鼠閉鎖卵泡的百分比為（19.6±0.9）%，顯著高于WT小鼠閉鎖卵泡的百分比（（8.7±0.6）%）（P＜0.001），此外，APN-/-組小鼠竇前卵泡和竇狀卵泡的比例分別為（14.7±1.1）%和（8.9±0.8）%，顯著低于WT小鼠的竇前卵泡（24.5±2.5）%和竇狀卵泡（13.6±0.3）%的比例（P＜0.01）。而在這三組基因型中，原始卵泡和初級卵泡的百分比則基本相同。

3.討論

脂肪組織對女性生育力調節起重要的作用，是因為它不僅可以進行能量儲備，同時還具有內分泌作用。脂聯素是一種重要脂肪因子，但肥胖癥患者的血清脂聯素水平反而是降低的。研究認為脂聯素對于雌性卵泡發育，甚至是雄性的精子獲能方面均有保護作用。

本研究發現脂聯素缺失可導致雌性小鼠生育力下降，特別是APN-/-組，每只雌鼠的產仔數量均顯著減少。與WT組相比，APN-/-組閉鎖卵泡比例明顯增加，同時竇前卵泡和竇狀卵泡比例顯著減少。說明脂聯素水平的降低可以導致雌性生育力下降，脂聯素對卵泡的發育成熟具有保護作用。卵泡發育是一個復雜過程，由多種激素控制，如雌激素、卵泡刺激素、黃體生成素和孕激素。研究表明可能影響卵巢的類固醇生成、卵泡發育和排卵，其基因表達的變化受到與卵泡發育相關激素的影響。而且在接受FSH治療的婦女，其血清脂聯素水平與體內獲得的卵母細胞數量呈正相關。雖然在月經周期中脂聯素濃度沒有變化，但在雌二醇和黃體酮的產生、顆粒細胞增殖、卵母細胞成熟和死亡中發揮重要作用。這些研究表明，脂聯素可能與卵泡的發育成熟和閉鎖有關。因此我們推測，脂聯素缺失導致的卵泡發育不良可能與卵泡發育相關激素水平的下降有關。與人類不同，小鼠有很高的繁殖能力，而在我們的研究中APN-/-小鼠表現出明顯的生育力降低。因此，我們推斷維持較高的血清脂聯素水平對人類女性生育力尤其重要，其具體的作用機制也將是我們下一步研究的重點。