氣相色譜-質譜聯用法測定植物油料中角鯊烯的含量及方法比較

呂春玲,陳小媚,王秀嬪,李培武,張 奇,張 文

(中國農業科學院油料作物研究所,湖北武漢 430062)

角鯊烯又名魚鯊烯、鯊烯、三十碳六烯等,化學式為C30H50,是一種高度不飽和脂肪族烴類化合物,角鯊烯最初是從鯊魚的肝油中發現的,是一種功能性活性脂質不皂化物[1-3]。其生理功能主要包括抗氧化、抗輻射、調節膽固醇代謝、提高體內超氧化物歧化酶活性[4-5]、防癌抗癌、增強機體免疫能力、皮膚保濕、抗衰老[6-7]和抑制微生物生長等。因此,角鯊烯被廣泛應用于醫藥產品、化妝品和功能性食品等相關產品的開發[8]。

食用植物油是人體生長和代謝過程不可缺少的三大基本營養素之一,同時含有豐富的特質營養成分,如甾醇、角鯊烯、生育酚、白藜蘆醇等[9-12]。隨著農業供給側結構性改革與質量興農戰略的實施,我國油料生產已從高產量向高質量多用途戰略轉變,植物油料特異品質檢測技術是發掘和利用特異營養品質實現高質量發展的關鍵,然而植物油料中微量特質營養成分檢測靈敏度低、技術匱乏嚴重制約油料品質提升與產業增效[13-15]。目前發現角鯊烯的替代來源主要以植物為主,油料作物如橄欖、油茶、大豆、花生、芝麻、油菜等種子中含有一定濃度的角鯊烯[16-18]。

目前,角鯊烯的測定方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質譜法、高效液相色譜法、超高效合相色譜以及超高效液相色譜法[19-21],樣品的前處理方法可分為傳統提取方法和新型提取方法,傳統提取方法有皂化法、結晶法以及有機溶劑提取法,新型提取方法包括固相微萃取法、超臨界二氧化碳萃取法以及固相萃取法[22-23]。但植物油料中角鯊烯的檢測,并未有相關文獻記錄,因此開發一種植物油料中角鯊烯的檢測方法顯得尤為重要。由于角鯊烯是一種植脂不皂化物,因此本文采取一種皂化方法先給植物油料的種子樣品脫脂,然后用正己烷萃取角鯊烯,用氣相質譜聯用法從復雜基質中分離出角鯊烯,因為相對其他儀器檢測方法氣質聯用法重現性好、靈敏度高、峰型尖銳干擾少、定量準確[24-26]。本實驗結果可應用于植物油料中角鯊烯的日常分析。氣質聯用法可以降低檢測限,提高油料中微量角鯊烯的檢測準確性,為植物油料的高質量發展提供技術支撐,為選育高角鯊烯含量的草本油料品種提供方法依據[27]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物油料 購自本地市場(湖北武漢)；樣品包括花生、大豆、芝麻和油菜籽,用高速研磨機磨成粉末,過60目篩，為防止所取樣品變質而影響數據的準確性,樣品均避光冷藏保存。角鯊烯(純度>98%) 色譜純,德國Dr. Ehrenstorfer公司;正己烷、乙醇 色譜純,國藥集團化學試劑有限公司;氫氧化鉀、氯化鈉 分析純,西隴化工股份有限公司。

氣相色譜質譜聯用儀、色譜柱HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國Agilent Technologies公司;Centrifuge-V 型離心機 美國Thermo Scientific公司;Milli-QA10型純水儀 美國Millipore公司;Tiss-46型均質儀 上海凈信科技;Auw220型分析天平 日本Shimadzu公司;DTC-27J 超聲波水浴鍋 中國湖北鼎泰生化技術設備制造有限公司;BF-2000型氮氣吹干儀 北京八方世紀科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 角鯊烯標準儲備液(1 mg/mL):準確稱取0.0100 g角鯊烯標準品于10 mL容量瓶中,用正己烷定容至刻度,混勻冷藏備用;角鯊烯標準中間液(100 mg/L):準確吸取1.00 mL角鯊烯標準儲備液于10 mL容量瓶中,用正己烷定容至刻度,混勻冷藏備用;角鯊烯標準工作溶液:分別吸取適量角鯊烯標準中間液,用正己烷稀釋,使標準工作溶液濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mg/L。

1.2.2 樣品處理 稱取已磨碎過篩試樣0.20 g放入15 mL離心管中,加入2 mL 2 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液,超聲皂化40 min(在75 ℃條件下)后;取出離心管,冷卻至室溫;加入2 mL水,1 mL正己烷提取,離心管至旋渦均質器中混勻3 min,充分提取;4500 r/min離心3 min,若出現乳化現象,加入1 mL飽和氯化鈉溶液破乳,4500 r/min再次離心3 min,轉移上清液至尖底玻璃試管中。再用1 mL正己烷重復此提取操作二次,并將三次提取上清液合并至尖底玻璃試管中,置于旋渦混合器中混勻,然后用氮吹儀吹干溶劑,再立即加入1 mL正己烷復溶,4500 r/min離心3 min,經0.22 μm有機相膜過濾后進樣。如果樣液中角鯊烯濃度超過標準工作曲線線性范圍,需將樣液用正己烷稀釋一定的倍數,使其濃度在線性范圍之內。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 氣相色譜參考條件 氣相色譜柱:HP-5(30 m×0.32 mm×0.25μm)色譜柱;載氣:高純氮氣(純度99.999%),恒壓:16 psi,分流比1∶12;進樣口溫度:320 ℃;柱溫采用程序升溫方式,100 ℃保持1 min,以40 ℃/min的速率從100 ℃升溫到290 ℃,保持20 min,然后以20 ℃/min的速率升溫到320 ℃,保持10 min;最后以40 ℃/min的速率降溫到100 ℃,保持1 min。FID檢測器:溫度320 ℃,氣流速200 mL/min,尾吹氣流速24 mL/min;進樣量:1.0 μL。

1.2.3.2 氣相色譜質譜聯用法參考條件 色譜柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25μm);升溫程序:200 ℃保持1 min,然后以25 ℃/min升溫至300 ℃,保持5 min,載氣為高純度氦氣,流速1.0 mL/min,進樣方式:分流,分流比50∶1,進樣體積是1 μL。質譜條件:GC-MS接口溫度300 ℃,進樣口溫度300 ℃,四級桿溫度150 ℃,離子源溫度230 ℃,電離方式EI源,電離電壓70 eV,選擇性離子監測(SIM)模式:m/z 69、81、95、137,定量離子為m/z 69,離子相對豐度m/z 69>81>95>137。

1.3 數據處理

使用Origin軟件處理分析數據。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的選擇

2.1.1 超聲皂化的溫度對角鯊烯含量的影響 稱取已磨碎過篩試樣0.20 g放入15 mL離心管中,加入2 mL 2 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液,分別在60、70、80、90、100 ℃條件下超聲皂化30 min后,取出離心管,冷卻至室溫;加入2 mL水,1 mL正己烷提取三次,將離心管放到旋渦均質器中混勻3 min,充分提取,最后經氣相色譜質譜聯用法測定角鯊烯的含量,得出不同皂化溫度對油菜籽中角鯊烯含量測定的影響,結果見圖1。由圖1測定的角鯊烯含量隨著皂化溫度的變化可知,油菜籽中角鯊烯含量隨著皂化溫度的升高而升高,在80 ℃時達到最大濃度后有下降趨勢。當反應溫度過高時,會破壞皂化液中的抗氧化成分,從而使得角鯊烯失去保護,導致其含量降低。因此,綜合經濟等因素選擇80 ℃為最佳皂化溫度。

圖1 皂化溫度對角鯊烯含量的影響Fig.1 Effect of saponification temperature on the content of squalene

2.1.2 超聲皂化的時間對角鯊烯含量的影響 稱取已磨碎過篩試樣0.20 g放入15 mL離心管中,加入2 mL 2 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液,分別在80 ℃條件下超聲皂化20、30、40、50、60 min后,取出離心管,冷卻至室溫;加入2 mL水,1 mL正己烷提取三次,將離心管放到旋渦均質器中混勻3 min,充分提取,最后經氣相色譜質譜聯用法測定角鯊烯含量,得出不同皂化時間對油菜籽中角鯊烯含量測定的影響,結果見圖2。

圖2 皂化時間對角鯊烯含量的影響Fig.2 Effect of saponification time on the content of squalene

由圖2測定的結果可以看出,隨著皂化時間的逐漸延長,角鯊烯的含量先增加后減少,皂化時間為40 min時,角鯊烯的濃度達到最大值,在高溫的堿性濃度下,隨著時間的延長,角鯊烯的結構遭到破壞,從而其含量有所降低。因此,綜合經濟等因素選擇40 min為最佳皂化時間。

2.1.3 超聲皂化的堿液濃度對角鯊烯含量的影響 稱取已磨碎過篩試樣0.20 g放入15 mL離心管中,分別加入2 mL 1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液,分別在80 ℃條件下超聲皂化30 min后,取出離心管,冷卻至室溫;加入2 mL水,1 mL正己烷提取三次,將離心管放到旋渦均質器中混勻3 min,充分提取,最后經氣相色譜質譜聯用法測定角鯊烯含量,得出不同皂化堿液濃度對油菜籽中角鯊烯含量測定的影響,結果見圖3。由圖3測得的結果可以看出,在堿液濃度低于2.0 mol/L時,由于反應速率較低,體系中角鯊烯的含量比較低,當堿液的濃度達到2.0 mol/L時,反應速率明顯增大很多,反應完全,角鯊烯含量上升明顯,但當堿液濃度繼續增大時,角鯊烯含量減少。因此,最佳堿液濃度為2.0 mol/L。

圖3 皂化堿液濃度對角鯊烯含量的影響Fig.3 Effect of KOH-C2H5OH solution concentration on the content of squalene

2.1.4 超聲皂化的萃取次數對角鯊烯含量的影響 稱取已磨碎過篩試樣0.20 g放入15 mL離心管中,分別加入2 mL 2.0 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液,分別在80 ℃條件下超聲皂化30 min后,取出離心管,冷卻至室溫;加入2 mL水,分別用1 mL正己烷萃取1、2、3、4、5次,將離心管放到旋渦均質器中混勻3 min,充分提取,最后經氣相色譜質譜法測定角鯊烯含量,得出不同皂化萃取次數對油菜籽中角鯊烯含量測定的影響,結果見圖4。由圖4測得結果可知,隨著皂化萃取次數的增加,油菜籽中角鯊烯含量先增加后減少,因為當正己烷萃取次數少時提取不完全,角鯊烯含量比較少;但當正己烷萃取次數較多時,角鯊烯的濃度反而減少,可能是由于有機試劑萃取過程中的損失,致使角鯊烯含量下降。因此,最佳皂化萃取次數為3次。

圖4 皂化萃取次數對角鯊烯含量的影響Fig.4 Effect of saponification extraction times on squalene content

2.2 氣相色譜質譜聯用法方法學驗證結果

2.2.1 角鯊烯的定性與定量離子選擇 用標準文庫NIST匹配了角鯊烯標準樣品的質譜,通過全掃描模式的質譜分析,匹配度為99%,確定了角鯊烯標準物質的主要碎片離子為m/z 69、81、95、137。然后設置選擇的離子監測模式。選擇離子監測模式對目標進行定量時,通常選擇靈敏度高、抗干擾能力強的碎片離子作為目標離子定量。因此角鯊烯的定量離子是m/z 69,定性離子是m/z 81、95、137。角鯊烯在SIM模式下的總離子流圖和質譜圖見圖5和圖6。

表1 角鯊烯的線性范圍以及檢出限Table 1 Linear ranges and limits of detection for squalene

表2 角鯊烯的準確度實驗結果Table 2 Accuracy test results of squalene

圖5 SIM模式下角鯊烯標準品的總離子流圖Fig.5 Total ion current diagram of squalene in SIM mode

圖6 SIM模式下角鯊烯標準品的質譜圖Fig.6 Mass spectrum of squalene in SIM mode

2.2.2 線性范圍和最低檢出限 取1.2.1中的標準儲備液,分別稀釋成6個濃度梯度,按2.1.1節優化后前處理皂化條件進行測定,并繪制角鯊烯標準品的質量濃度(橫坐標x,mg/L)與峰面積(縱坐標y,AU)標準曲線,進行線性回歸分析,得到線性回歸方程y=14106x-5987,線性相關系數0.9998。且當信噪比(S/N)為3和10時,該方法的最低檢出限及定量限如表1所示。結果表明,無論是使用GC還是GC-MS/MS法測定角鯊烯的含量,都具有良好的線性相關性,均能滿足對植物油料中的角鯊烯進行檢測的要求。

2.2.3 樣品準確度和精密度實驗結果 在油菜籽、大豆、和芝麻樣品中,分別添加 2.50、5.00 mg/kg的角鯊烯標準品,在花生樣品中添加25.00、50.00 mg/kg的角鯊烯標準品,前處理方法按2.1.1節優化后的前處理皂化條件進行測定,測定后計算回收率,結果見表2。由表2中的結果可見,四種不同植物油料的加標回收率在83.60%～110.44%之間,平均回收率為98.89%,說明該方法的準確度滿足方法學要求,適合植物油料中角鯊烯含量的測定。

對油菜籽、大豆、芝麻和花生樣品分別重復測定7次,結果見表3。由表3可知,油菜籽、大豆、芝麻和花生中角鯊烯測定結果的相對標準偏差(RSD)分別為 3.34%、3.35%、2.38%、1.00%,說明該方法具有良好的精密度,重現性好。

2.2.4 氣相色譜法和氣相色譜質譜法檢測結果的比較 為了更好的證明方法的準確性,隨機抽取4個植物油料種子,分別用不同的檢測方法進行對比試驗,按2.1.1節優化的前處理皂化條件進行操作后,按照1.2.3的色譜條件進行測定,結果見表4。

表3 角鯊烯的精密度實驗結果Table 3 Precision experiment results of squalene

表4 不同檢測方法的比對結果Table 4 Comparison results of different detection methods

由表4可知,GC-MS/MS的檢測結果和GC的檢測結果相對誤差小于10%,兩種方法的檢測結果基本一致,均能滿足檢測的要求,檢測結果可靠。從已有的相關文獻報道得知氣相色譜法和氣相色譜質譜聯用法同樣適用于植物油脂和小宗油料樣品中角鯊烯的檢測。相對于氣相色譜法,氣相色譜質譜聯用法不但檢測靈敏度更高,還節約時間成本大大提高檢測效率,適合植物油料中角鯊烯含量的測定。

3 結論

綜上,本文建立了氣相色譜質譜聯用法測定植物油料中角鯊烯含量的方法。優化了氫氧化鉀乙醇溶液超聲皂化的條件:皂化最佳溫度80 ℃,皂化最佳反應時間40 min,皂化最佳堿液濃度2.0 mol/L,最佳萃取次數3次。該方法角鯊烯的最低檢測限為 0.10 mg/L,相對標準偏差在1.00%～3.35%(n=7),加標回收率在83.60%～110.44%之間,說明該方法重現性好,靈敏度高,定量準確。并用氣相色譜質譜聯用法和氣相色譜法測定了四種不同植物油料中角鯊烯的含量,結果表明,兩種方法均能滿足檢測要求,氣相色譜質譜聯用法檢出限低,分離效率高,定量準確,更適合植物油料中微量角鯊烯含量的測定,并對植物油料的高質量發展具有一定的指導意義。