具有聚集誘導發紅光性質的鄰菲啰啉釕配合物的合成及其細胞成像研究

王 慧*， 胡 磊， 沈學彬， 吳運軍

(皖南醫學院藥學院，安徽蕪湖 241002)

發光金屬配合物在分子傳感器、生物成像探針和光催化等諸多研究領域具有潛在的應用價值，已經成為近年來科學研究的熱點[1,2]。一般來說，有機配體和金屬配合物在稀的非水溶液中表現出明亮的熒光，但在聚集狀態下或固態下由于聚集引起的猝滅(ACQ)而發出非常微弱的熒光。2001年，唐本忠研究小組報道了一種與ACQ完全相反的新現象，稱之為“聚集誘導熒光增強”(AIE)效應[4]。AIE材料在良性溶劑中不發光或發出微弱的熒光，但這些材料在聚集態或固態下發出強烈的熒光。隨著對AIE研究的不斷深入，研究者們提出了很多機理，如形成J-聚集體、扭轉的分子內電荷轉移、分子內平面化、非緊密堆積、形成特殊激基締合物等[5 - 7]。目前AIE材料已經廣泛應用于生物傳感、細胞亞細胞器成像和光動力學等研究方面[8 - 11]。雖然很多具有AIE效應的分子被報道，但大多數AIE分子的發射波段處于藍綠光區，而具有紅光發射特性的AIE材料(發射波長>600 nm)的種類和數量非常有限。紅光AIE材料具有穿透能力強、對生物樣品的損傷小、信噪比高等優勢，但也存在量子產率低、光穩定性差等缺點[12]，因此，設計合成具有紅光AIE效應的分子具有重要的科學意義。

Ru(Ⅱ)配合物具有較大的斯托克斯位移、好的光穩定性、長的熒光壽命等優勢，已受到科研工作者越來越多的青睞[13,14]。鄰菲啰啉具有較強的配位能力、好的平面性、容易修飾等優點，與Ru(Ⅱ)形成的配合物，已經被廣泛應用于非線性光學材料、抗腫瘤藥物和DNA探針等領域[15,16]?；诖?，我們以4-丁氧基苯甲醛和鄰菲啰啉雙酮為原料，設計合成了一種新型的鄰菲啰啉衍生物L，并于[Ru(phen)2]Cl2組裝成相應的配合物LRu，在分子中引入丁基不僅能夠增加電子的離域，而且能夠提高分子的溶解性。研究了配合物LRu在不同極性的溶劑及不同體積比的乙醇和水混合溶液中的光學性質。初步探索了配合物LRu在Hela細胞中的成像情況。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance 600核磁共振儀(美國，布魯克公司)；solanX 70 FT-MS質譜儀(美國，布魯克公司)；Nicolet FT-IR-is5紅外光譜儀(KBr壓片)(日本，島津有限公司)；UV-5900PC型紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)；HITACHI F-4600熒光分光光度計(日本，日立公司)；INFINITE 200 PRO多功能酶標儀(瑞士，Tecan公司)；Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(德國，徠卡公司)。

鄰菲啰啉(99%)，溴代正丁烷(99%)，對羥基苯甲醛(98%)，NH4Ac，六氟磷酸鉀(KPF6,99%)，三氯化釕水合物(35.0%～42.0% Ru basis)，氯化三(2,2′-聯吡啶)釕(Ⅱ)·六水(98%)，其它試劑均為分析純，購自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 LRu的合成

1.2.1 化合物L的合成在250 mL三口燒瓶中，依次加入0.74 g(3.5 mmol)鄰菲啰啉雙酮[17]，0.62 g(3.5 mmol)4-丁氧基苯甲醛[18]，5.75 g(75 mmol)NH4Ac和75 mL冰HAc，在氮氣保護下，120 ℃反應4 h，反應結束后，冷卻至室溫后，倒入大量冰水中，用飽和K2CO3溶液調節pH至7，有固體析出，減壓抽濾，粗產物用甲醇重結晶，得淡褐色固體0.55 g，產率：42.9%。

1H NMR(600 MHz,d6-DMSO)：δ:8.98(d,J=4.0 Hz,2 H),8.87(d,J=8.0 Hz,2 H),8.18(d,J=8.5 Hz,2 H),7.77～7.79(m,2 H),7.11(d,J=8.4 Hz,2 H),4.02(t,J=6.4 Hz,2 H),1.74～1.66(m,2 H),1.49～1.38(m,2 H),0.91(t,J=7.4 Hz,3 H)。13C NMR(151 MHz,d6-DMSO)：δ:160.31,151.24,148.02,143.86,129.94,128.22,123.63,122.93,115.28,67.80,31.17,19.17,14.14。

1.2.2 配合物LRu的合成在100 mL三口燒瓶中，依次加入0.17 g(0.35 mmol)[Ru(phen)2]Cl2[17]，0.33 g(0.33 mmol)化合物L和50 mL甲醇，氮氣保護下，回流反應24 h，反應結束后，向其中加入KPF60.92 g(5 mmol) 繼續反應4 h，反應液經減壓蒸餾除去甲醇得固體，然后用15 mL二氯甲烷溶解，減壓抽濾得濾液，無水MgSO4干燥過夜，所得粗產物經硅膠柱層析分離，洗脫溶劑為二氯甲烷/甲醇(V/V=50/1)混合溶劑，得紅色固體0.15 g，產率：41.6%。

配合物LRu的合成路線見圖1。

圖1 配合物LRu的合成路線Fig.1 Synthesis routes of complex LRu

IR(KBr,cm-1):3451,2929,1611,1481,1456,1427,14906,1365,1250,1177,838,739,720,557。1H NMR(400 MHz,d6-DMSO)：δ:14.16(s,1 H),9.05(t,J=8.6 Hz,2 H),8.78(d,J=8.2 Hz,4 H),8.40(s,4 H),8.25(d,J=8.7 Hz,2 H),8.17～8.05(m,4 H),8.01(d,J=5.2 Hz,2 H),7.87～7.72(m,6 H),7.23(d,J=8.8 Hz,2 H),4.10(t,J=6.5 Hz,2 H),1.82～1.70(m,2 H),1.57～1.40(m,2 H),0.97(t,J=7.4 Hz,3 H)。13C NMR(101 MHz,d6-DMSO)：δ:161.03,153.44,147.53,137.28,130.92,128.29,126.64,115.70,88.22,68.08,31.02,19.05,14.07。HR-MS:計算值:829.9300,測得值：829.0815 [M-2PF6]+。

1.3 細胞毒性測試與細胞染色

1.3.1 細胞毒性測試將人宮頸癌細胞(Hela)接種于96孔板上，在37 ℃和5%CO2條件下培養，當細胞密度長至85%左右時，向孔中加入配合物LRu，使其最終濃度分別為5、10、15、20、25 μmol/L，每組濃度設三個平行實驗，同時設置對照孔和調零孔。當配合物LRu與Hela共孵育24 h后，每孔加入20 μL 的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽溶液(MTT)(5 mg/mL)，繼續培養4 h，除去96孔板中的培養基(DMEM)，并加入100 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀測量波長490 nm處各孔的吸光度。

1.3.2 細胞染色將人宮頸癌細胞(Hela)接種于共聚焦培養皿上，在37 ℃和5%CO2條件下培養，當細胞密度長至65%左右時，進行以下兩組實驗：(1)配合物LRu與Hela細胞共孵育20 min；(2)首先移除培養皿中的DMEM，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌2次，然后加入1.5 mL 4%多聚甲醛培養15 min，用PBS洗滌2次，最后加入2 mL含有配合物LRu(10 μmol/L)的DMEM，繼續培養20 min。孵化好的Hela細胞用PBS洗滌3次，直接用于顯影。

2 結果與討論

2.1 配合物LRu的線性光學性質

選取苯、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯(EA)、乙醇(EtOH)、乙腈、二甲基亞砜(DMSO)和水7種不同極性的溶劑，研究溶劑對配合物LRu吸收光譜和熒光光譜的影響。圖2A是配合物LRu在不同極性溶劑中的紫外-可見吸收光譜圖。配合物LRu在不同極性溶劑中的吸收峰位置幾乎不隨溶劑極性的變化而變化，只是吸收峰的強度略有差別。配合物LRu在不同極性溶劑中的最大吸收峰位于460 nm左右，可歸屬于配體到金屬的躍遷(LMCT)。為了更好的理解吸收光譜和電子結構之間的關系，利用密度泛函理論(TD -DFT/B3LYP)對配合物LRu的躍遷過程進行計算，采用Gaussian 09程序，6-31G基組對C、H、N、O原子及LANL2DZ基組對Ru原子。圖3和表1是配合物LRu的分子軌道能級圖和理論計算的相關數據。由圖3和表1可知，理論計算出的配合物LRu最大吸收峰在458 nm左右，是最高占有分子軌道(HOMO)到最低未占分子軌道(LUMO)的躍遷，其中HOMO軌道上的電子云主要分布在配體L上，LUMO軌道上的電子云主要分布在中心金屬Ru原子和配體鄰菲啰啉上，可歸屬于配體到金屬的躍遷混有配體到配體的躍遷。理論計算出的最大吸收峰位置與實驗測得的結果相符合，為解釋配合物LRu的紫外-可見吸收光譜提供了理論依據。

表1 配合物LRu的理論計算相關數據

圖3 配合物LRu的分子軌道能級圖Fig.3 Molecular orbital energy diagram for LRu

圖2B是配合物LRu在不同極性溶劑中的熒光光譜圖。配合物LRu的測試濃度為10 μmol/L，熒光光譜的測試條件為激發波長460 nm,狹縫寬度為10.0 nm，電壓為500 V。配合物LRu的最大發射峰在602 nm左右，斯托克斯位移為142 nm，且其發射峰位置隨溶劑極性的增加變化不明顯。以[Ru(bpy)2]Cl2(在乙腈溶液中的量子產率φ=0.062)為參比[19]，根據量子產率公式[20]計算得到配合物LRu在不同溶劑的中的量子產率分別為0.13(苯)、0.12(四氫呋喃)、0.10(乙酸乙酯)、0.04(乙醇)、0.10(乙腈)、0.36(二甲基亞砜)和0.35(水)。而且配合物LRu在DMSO和水溶液中的熒光強度比其他溶劑的強，以乙醇為例，LRu在水中的熒光強度約是其在乙醇中的8倍。在365 nm紫外燈照射下，配合物LRu在純乙醇(0%)中呈現出微弱的紅光，在水(99%)中呈現出明亮的紅色熒光，且在固體狀態下，LRu也發出明亮的紅色熒光，造成這一現象的原因可能是聚集誘導熒光增強。

圖2 配合物LRu(10 μmol/L)在不同溶劑中的紫外-可見吸收光譜(A)和熒光光譜(B)Fig.2 UV-Vis absorption spectra(A) and fluorescence spectra of complex LRu (c=10 μmol/L) in different solvents

此外，還探究了配合物LRu在PBS中的穩定性。在相同的測試條件下，時間間隔為2 h，測試配合物LRu的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜，從圖4中可以看出隨著時間的延長，配合物LRu的吸收峰位置和熒光強度沒有發生明顯的變化，說明配合物LRu具有好的穩定性，可將其應用于生物體內。

圖4 在不同的時間節點配合物LRu在PBS中的紫外-可見吸收光譜(A)和熒光光譜(B)Fig.4 UV-Vis absorption spectra(A) and fluorescence spectra (B) of LRu (c=10 μmol/L) in PBS under different time

2.2 聚集誘導熒光性質

選擇乙醇作為配合物LRu的良性溶劑，水作為不良溶劑，配制成不同含水量(fw=0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、99%)的混合溶液，測試配合物LRu的熒光光譜，配合物LRu的測試濃度為10 μmol/L。如圖5所示，隨著水含量的增加，配合物LRu的熒光強度逐漸增強。當fw=80%時，配合物LRu的熒光強度達到最大，比純乙醇增強約6.7倍，這是典型的聚集誘導熒光增強性質，且熒光發射峰位置由590 nm紅移到602 nm。這是由于水分子的加入，降低了配合物的溶解性，使其聚集成顆粒，在聚集狀態下，配合物中單鍵的自由旋轉受到限制，抑制了激發態的非輻射躍遷，最終導致配合物的熒光強度增強[7,21]。

圖5 (A) 配合物LRu在不同體積比乙醇/水混合溶液中的熒光光譜圖；(B) 配合物LRu的熒光強度與水體積分數的關系Fig.5 (A) Fluorescence spectra of complex LRu in ethanol/H2O mixtures with different water fraction；(B) The changes of fluorescence peak intensity of complex LRu with different water fractions

2.3 細胞毒性測試和細胞顯影

首先利用MTT方法測試了配合物LRu的細胞毒性(圖6)，當配合物LRu與Hela細胞作用24 h，細胞的存活率在80%以上，說明配合物LRu具有較低的細胞毒性，可將其安全地應用于活細胞成像。為進一步研究配合物LRu在細胞內的分布情況，利用Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡對配合物LRu進行細胞成像研究。

圖6 配合物LRu與Hela細胞作用24 h后的細胞存活率Fig.6 Cell viabilities of Hela cells incubated with complex LRu for 24 h

將Hela細胞與10 μmol/L LRu共孵育20 min，如圖7所示，在細胞周圍觀察到強的紅色熒光信號，通過與明場圖疊加，發現熒光信號主要來源于細胞的細胞膜區域。同時研究了配合物LRu在不同焦平面下的細胞成像實驗，如圖8所示，LRu在不同焦距下的熒光信號也主要來源于細胞膜區域。當用4%多聚甲醛固定Hela細胞后(圖7)，發現配合物LRu主要著色于細胞的細胞質部位。說明配合物LRu可靶向在活細胞的細胞膜部位。

圖7 配合物LRu在活細胞和固定的Hela細胞中的細胞成像圖Fig.7 Cell images of live and fixed Hela cells incubated with LRu

圖8 (A)在不同焦平面下配合物LRu孵育Hela細胞20 min后的共聚焦成像圖；(B) 配合物LRu在Hela細胞中的3D成像圖Fig.8 Confocal images of Hela cells incubated with LRu for 20 min under different focal lengths；(B) 3D imaging of LRu in Hela cells

高的光穩定性有利于化合物長時間進行細胞成像進而追蹤細胞生理狀態的變化過程。配合物LRu的光穩定性測試如圖9所示，用激光不間斷的掃描配合物LRu孵育的Hela細胞760 s，LRu的熒光強度在80%以上，說明配合物LRu具有比較好的光穩定性。與文獻已報道的材料相比[22 - 25]，配合物LRu具有較好的光穩定性、生物相容性、大的斯托克斯位移和較高的量子產率，且能靶向在活細胞的細胞膜部位。但其自身也存在一些不足，如配合物LRu的最大發射峰在602 nm左右，發射波長較短。

圖9 配合物LRu在細胞中的光穩定性Fig.9 Photostability of LRu in cell imaging

3 結論

設計合成了一種新型的鄰菲啰啉釕配合物LRu，借助紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、理論計算、MTT測試和共聚焦顯微成像系統地研究了配合物的光物理性質及細胞成像。研究結果表明：(1)在不同體積比的乙醇和水混合溶液中，配合物LRu展現出明顯的聚集誘導熒光增強性質，發射波長在602 nm左右，且當含水量達到80%時，熒光強度增強約6.7倍；(2)配合物LRu具有較高的細胞存活率和高的光穩定性，可靶向活細胞的細胞膜部位。該研究結果為后期設計具有聚集誘導發紅光性質的釕配合物提供了實驗基礎和設計思路。