基于石墨烯-金納米粒子復合材料的黃芩苷電化學傳感器的構建及應用

史艷梅， 張 茜， 張俊霞， 李秀敏， 苗明三*

(1.河南中醫藥大學中醫藥科學院，河南鄭州 450001；2.紐約醫學院微生物和免疫學系，美國紐約 10595)

黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，其藥用價值廣泛，為臨床常用中藥之一。黃芩苷(Baicalin，BA)作為中藥黃芩的主要活性成分，具有抗炎[1]、抗過敏[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]、抗腫瘤[5]的藥理作用。市場上含黃芩的中藥制劑種類繁多，而BA常被作為標志物用于藥物的質量控制，所以建立快速靈敏的BA檢測方法具有重要意義。目前，BA常用的檢測方法有高效液相色譜法[6]、紫外分光光度法[7]、液-質聯用法[8]和電化學方法[9]等。其中，電化學方法因具有儀器操作簡單、快速、靈敏度高等優點而備受關注[10]。眾所周知，電化學傳感器的優良性能取決于提高傳感材料的電活性面積及電子傳輸能力。因此，構建高電活性的納米傳感復合材料在電化學分析中具有重要意義。

還原氧化石墨烯(rGO)是一種優良的二維蜂窩狀納米材料，碳原子sp2的雜化方式使其具有獨特的片層結構從而具有較大的比表面積[10]，廣泛應用于電化學領域。然而rGO在制備過程中會產生一些結構缺陷，影響其導電性能[11]。金納米粒子(Au NPs)具有導電性好和比表面積大的優勢，結合在rGO表面后通過協同作用可進一步增強納米復合材料的比表面積及電子轉移速率，同時可以有效防止rGO片層間的聚集，提高rGO材料的電化學檢測性能[12]。本研究利用原位還原法制備了Au NPs@rGO納米復合材料，并應用于構建BA電化學傳感器。對實驗條件進行了優化，并對BA的電化學反應機理進行了分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)；三電極系統：工作電極為玻碳電極(GCE，Φ=3 mm)或修飾GCE，參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉑絲電極；高效液相色譜儀(Waters 2695);電子分析天平(ME204，Mettler Toledo)； pHS -3C pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；ELGA Centra R200超純水機(UK)。

黃芩苷(BA)(≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6](天津光復科技有限公司)；檸檬酸鈉、KCl、KH2PO4、Na2HPO4(天津科密歐化學試劑有限公司)；Nafion溶液(Nafion D -520分散液，阿法埃莎化學有限公司)；石墨粉(≥325目，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；HAuCl4·3H2O(ACROS公司)。實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

雙黃連口服液(河南太龍藥業股份有限公司)。

1.2 Au NPs@rGO納米復合材料的制備

采用Hummers法以石墨粉為原料制備氧化石墨烯(GO)[13]。取25 mL 4.0 mg/mL的GO懸浮液，超聲分散，在攪拌下加入200 μL 1%的HAuCl4并加熱至80 ℃，逐滴加入1.2 mL 80%的水合肼溶液，80 ℃下加熱回流2 h，8 000 r/min離心，水洗3次，重新分散在25 mL水中即得到Au NPs@rGO復合物。取5 mL Au NPs@rGO與0.5%Nafion溶液(1∶1)混合，即得修飾電極的納米復合材料AuNPs@rGO。

1.3 修飾電極的制備

分別用0.3、0.05 μm的Al2O3拋光粉將GCE表面打磨至鏡面狀，依次用乙醇和水各超聲清洗1 min，晾干后，吸取5 μL Au NPs@rGO -Nafion分散液滴涂在GCE表面，紅外燈下干燥后，即可得到修飾電極Au NPs@rGO -Nafion/GCE。

1.4 電化學檢測

在含有BA的0.25 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.0)中，采用三電極工作體系，在攪拌作用下富集3 min，然后在-0.2～0.7 V范圍內進行掃描，利用循環伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)進行測量。測量結束后，用水沖洗電極，隨后在空白PBS中掃描更新電極表面。所有測量均在室溫下進行。

2 結果和討論

2.1 Au NPs@rGO復合材料的表征

利用掃描電鏡(SEM)對Au NPs@rGO復合材料形貌進行分析。如圖1所示，電極表面具有眾多褶皺，顯著增大了電極的比表面積，同時看到Au NPs均勻的分布在rGO表面，表明Au NPs@rGO復合材料構建成功。

圖1 Au NPs@rGO復合材料的掃描電子顯微鏡(SEM)照片Fig.1 SEM image of Au NPs@rGO composite material

2.2 Au NPs@rGO -Nafion/GCE的電化學表征

為了評價Au NPs@rGO -Nafion/GCE的電化學性能，以[Fe(CN)6]3-/4-溶液作為探針，進行循環伏安(CV)掃描。由圖2可知，裸GCE上有一對典型的氧化還原峰，峰電位差為73 mV，接近理論值69 mV，說明電極狀態良好，適用于制備修飾電極。在rGO -Nafion/GCE上進行測定時，探針響應峰電流及背景電流明顯增加；且在Au NPs@rGO-Nafion/GCE上時，響應峰電流及背景電流進一步顯著提升，推測可能是由于Au NPs@rGO復合材料顯著提高了電極比表面積，進而增加了反應的活性位點致使其電化學信號顯著增強。為了更好地闡釋復合材料Au NPs-@rGO對電活性比表面積的影響，利用CV法對其進行了探究，根據Randles-Sevcik公式[14]可計算出Au NPs@rGO -Nafion/GCE和GCE的電活性比表面積分別為0.229 cm2和0.117 cm2。

圖2 GCE(a)、rGO -Nafion/GCE(b) 和Au NPs@rGO -Nafion/GCE(c)在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循環伏安(CV)圖Fig.2 CVs of bare GCE(a),rGO -Nafion/GCE(b) and Au NPs@rGO -Nafion/GCE(c) in [Fe(CN)6]3-/4-solutionscan rate:125 mV/s.

2.3 BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的電化學行為

圖3(A)分別為GCE、rGO -Nafion/GCE、Au NPs@-rGO -Nafion/GCE在5 μmol/L BA中，在125 mV/s掃速下的CV曲線。GCE在0.177 V處出現一個弱的氧化峰，說明裸GCE的吸附能力較弱，電化學反應較慢；在rGO -Nafion/GCE上出現一對典型的氧化還原峰，且響應電流明顯增加；而在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上，響應電流進一步增強，說明由于Au NPs@rGO納米復合材料大的比表面積和良好的導電能力，增強了BA的電化學反應性能。為了研究反應動力學，考察了BA在不同掃描速度下的電化學行為。如圖3(B)所示，隨著掃速的增加，響應電流也逐漸增加。在掃描速率在0.025～0.3 V/s的范圍內，峰值電流與掃描速度之間呈良好的線性關系(圖3(C))，推斷BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上是吸附控制的過程。同時，由圖3(B)可知響應峰電位隨掃速的變化也隨之變化，其氧化峰電位(Epa)與掃描速率的對數(lnv)線性關系良好(圖3(D))，根據Laviron理論[15]，可計算出BA的電子傳遞數n為2.2≈2，α值是0.69。采用計時電量法(Q-t)評估BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的飽和吸附量。圖3(E)為Au NPs@-rGO -Nafion/GCE在5 μmol/L BA溶液(a)及PBS空白溶液(b)中的Q-t曲線，對應的Q-t1/2曲線展示在圖3(F)中。如圖3(F)所示，曲線a和b的斜率幾乎相等，進一步證明了該電化學反應是吸附控制的過程。根據公式:Q=nFAΓ*計算，BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的飽和吸附量(Γ*)為3.8×10-9mol/cm2。

圖3 (A)不同電極在BA溶液中的CV圖；(B)BA在不同掃描速率下的CV圖(a→l：0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3 V/s)；(C)電流和掃描速率之間的校正曲線；(D)Epa和lnv之間的校正曲線；(E)Au NPs@rGO -Nafion/GCE在BA溶液(a)和空白溶液(b)中的計時電量曲線(Q-t)；(F)Q和t1/2之間的校正曲線Fig.3 (A) CVs of different electrodes in baicalin solution;(B) CVs of baicalin at different scan rates(a→l:0.025,0.05,0.075,0.1,0.125,0.15,0.175,0.2,0.225,0.25,0.275,0.3 V/s);(C) Calibration curve between oxidized current and scan rate;(D) Calibration curve between Epa and lnv;(E) Chronocoulometric curve(Q -t) of Au NPs@rGO -Nafion/GCE in baicalin solution(curve a) and blank solution(curve b);(F) Calibration curve between Q and t1/2

2.4 實驗條件的優化

2.4.1 底液pH值和濃度的影響在5 μmol/L BA溶液中，對支持電解質PBS的pH值(2.0～9.0)和濃度(0.1～0.35 mol/L)進行了優化。如圖4(A)所示，pH=7.0時峰電流達到最大值，隨后開始減小，因此選擇7.0作為測定BA的最佳pH值。同時發現，隨pH增大，響應峰電位向負電位方向移動，說明有質子參與該電極反應[16]。由圖4(B)可知Epa與pH之間存在線性關系，回歸方程為：Epa=-0.0537pH+0.5821，R2=0.9922。方程的斜率與理論值0.059 V/pH相近，說明BA在修飾電極上是等質子等電子的過程，鑒于計算所得電子轉移數為2，可知兩個質子兩個電子參與了BA的電化學反應。如圖4(B)所示，PBS濃度在0.1～0.25 mol/L范圍內，BA氧化峰電流隨PBS濃度的增大而增大，而后繼續增加其濃度，響應電流反而減小，故PBS的最佳濃度設定為0.25 mol/L。

2.4.2 富集時間的影響在吸附控制的電化學反應中，富集時間是影響檢測靈敏度的又一重要參數?？疾炝烁患瘯r間對5 μmol/L BA氧化峰電流的影響，結果如圖4(C)所示，隨富集時間增加，響應電流逐漸增大，至180 s時，吸附量趨于飽和，之后變化緩慢，選擇180 s為最佳的富集時間。

圖4 (A)pH對響應電流的影響；(B) PBS濃度對響應電流的影響；(C) 富集時間對響應電流的影響Fig.4 (A)Effect of pH on response current;(B) Effect of PBS concentration on response current;(C) Effect of enrichment time on response current

2.5 標準曲線及檢出限

在最佳實驗條件下，利用差分脈沖伏安法(DPV)研究了不同濃度BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的電化學響應。圖5可以觀察到峰電流隨著BA濃度的增大而增加，在0.05～10 μmol/L范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程為：Ipa=-18.953c-6.8269，R2為0.9961，檢出限(S/N=3)為0.01 μmol/L。說明BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上具有較高靈敏度。

圖5 不同濃度BA(a→h:0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μmol/L)在PBS(pH=7.0中的DPV圖(插圖是BA濃度與電流之間的校正曲線)Fig.5 DPV of different concentration of BA(a→h:0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μmol/L) in PBS buffer (pH=7.0)(The insert was the calibration plot between current and BA concentration)

2.6 重現性、穩定性和干擾實驗

按照上述制備方法，平行制備5根修飾電極，在最佳條件下放入2 μmol/L的BA溶液中依次測定，結果顯示，傳感器相對標準偏差為3.53%，具有良好的重現性。將使用過的修飾電極，在冰箱中放置7 d后再次進行測量，響應電流值為初始電流的92.20%，具有較好的穩定性。

在最佳實驗條件下，評估了幾種可能的干擾物對電極檢測能力的影響。當BA濃度為2 μmol/L，在允許相對誤差為5%時，300倍Ca2+、Mg2+、Zn2+，100倍尿酸，50倍的多巴胺、抗壞血酸對BA信號無影響。說明該方法具有良好的選擇性，可以應用于實際檢測中。

2.7 實際樣品的測定

利用所建立的方法，對雙黃連口服液中BA含量進行測定。分析前取適量的雙黃連口服液，用pH為7.0的0.25 mol/L的PBS稀釋50倍，0.22 μm濾膜過濾后進行電化學測定，計算得到稀釋后口服液中BA的含量為2.78 μmol/L。進一步在該待測液中進行BA加標回收實驗，其回收率在99.60%～105.3%之間，RSD低于3.12%。為了驗證該傳感器的準確性，利用HPLC法對雙黃連口服液中BA的濃度進行檢測。色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：0.6%冰HAc(A相)，乙腈(B相)；洗脫條件：0～4 min，15%→18%B；4～10 min，18%→25%B；10～20 min，25%→30%B；流速：1.0 mL/min；檢測波長為300 nm，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。測得實際樣品中BA的含量為2.65 μmol/L，RSD為1.89%。電化學方法與HPLC法所得結果相吻合，證明所制備的Au NPs@rGO -Nafion/GCE對實際樣品的測定具有較高的準確度。

表1 實際樣品中BA的測定結果

3 結論

利用原位還原法制備了Au NPs@rGO納米復合材料，并用于構建高靈敏的BA電化學傳感器。在最優條件下，BA在0.05～10 μmol/L范圍內線性關系良好，檢出限為0.01 μmol/L。所構建的Au NPs-@rGO -Nafion/GCE傳感器為中藥制劑中BA的快速靈敏檢測提供了新方法。