高穩定性熒光納米SiO2的合成及其在磷脂巨型囊泡成像中的應用

張衛紅*， 魏露露， 劉菲菲， 李甜甜

(咸陽師范學院化學與化工學院，陜西咸陽 712000)

熒光納米顆粒在生物標記、細胞成像、免疫分析等領域里有著廣泛的應用前景[1 - 3]。目前常用的熒光納米顆粒有各種量子點[4 - 7]、納米Ag2S[8]、納米SiO2[9 - 11]、鑭系金屬[12]和熒光碳點[13]等。其中，熒光納米SiO2由于性質穩定、無細胞毒性而受到廣泛關注。熒光納米SiO2制備可用反相微乳液法[14,15]，但微乳液制備難度較大，后處理步驟也比較繁瑣。而制備納米SiO2最常用的St?ber法合成過程較為簡單，如能對合成過程進行合理設計，亦可制備出粒徑均勻的熒光納米SiO2顆粒[16]，該方法有望在熒光納米SiO2的合成及應用領域發揮更大的作用。

磷脂巨型囊泡是尺寸在幾微米至上百微米的一類具有封閉薄球殼結構、內包微水相的分子有序組合體[17]，其殼層組成、結構及尺寸均類似于生物體中的細胞，是一種模擬細胞簡單而理想的模型[18]。磷脂巨型囊泡與納米顆粒的相互作用研究可以揭示生物礦化等生命現象，但兩者尺寸相差巨大，而且磷脂巨型囊泡僅可在內外滲透壓均衡的水溶液中穩定存在，用掃描電鏡等傳統檢測手段很難觀測到兩者的相互作用過程?；诖?，將具有熒光性能的納米顆粒與磷脂巨型囊泡接觸，并借助熒光顯微鏡觀測兩者的相互作用過程就顯得尤為必要。本研究在St?ber法的基礎上，通過接枝異硫氰酸熒光素(FITC)并改變反應溶劑種類的方式，合成了三種不同粒徑的熒光納米SiO2顆粒，對比分析了粒徑大小對熒光強度以及抗光漂白能力的影響。在此基礎上，通過簡單混合的方法將熒光納米顆粒與磷脂巨型囊泡相接觸，通過熒光顯微鏡觀察分析熒光納米顆粒與磷脂巨型囊泡相對位置的變化，推測出兩者的相互作用機理模型。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

激光粒度儀(Zetasizer Nano ZS3600，Malvern，英國)；透射電鏡(H-7650，Hitachi，日本)；激光共聚焦顯微鏡(FV1200，Olympus，日本)；熒光光譜儀(RF5301，Shimadzu，日本)；倒置熒光顯微鏡(TE2000，Nikon，日本)。

異硫氰酸熒光素(FITC)，90%，麥克林試劑有限公司；氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、無水乙醇、甲醇、異丙醇和三氯甲烷，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；正硅酸乙酯(TEOS)和氨水(25%～28%)，均為分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；L-α磷脂酰膽堿，99%，Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 FITC-APTES制備2 mg的FITC溶于2 mL無水乙醇中，再加入40 μL的APTES，室溫下避光攪拌反應24 h，即得熒光前驅體FITC-APTES。

1.2.2 不同粒徑熒光納米SiO2合成在磁力攪拌下，向100 mL圓底燒瓶中依次加入甲醇30 mL、氨水2.0 mL和TEOS 1.0 mL，室溫攪拌5 min后，向其中加入200 μL的FITC-APTES，遮光攪拌12 h；為有效保護熒光物質，得到純凈的SiO2表面，再向其中加入200 μL的TEOS，繼續攪拌反應12 h；反應結束后，向溶液中加入50 mL純水，用旋轉蒸發儀除去氨及甲醇，實現溶液置換，然后在純水中避光透析5 d除去游離的FITC分子，用純水稀釋至納米顆粒濃度為2 mg/mL，備用。

在配方相同的情況下將溶劑由甲醇改為乙醇和異丙醇即可得到粒徑依次增大的熒光納米SiO2。

1.2.3 熒光納米SiO2用于磷脂巨型囊泡成像磷脂巨型囊泡采用電形成法[19]制備，具體操作如下：取兩塊尺寸為6 cm×4 cm且表面鍍有氧化銦錫(ITO)的玻板，各吸取2 mg/mL的L-α磷脂酰膽堿的三氯甲烷溶液25 μL滴于兩塊ITO玻板上，刮涂均勻，將其置于真空烘箱中室溫抽真空2 h除去溶劑，取出后向涂有磷脂膜的一面左上角粘上一片2 cm長的導電銅膠帶，再取外框尺寸為5 cm×3 cm、內框尺寸為4 cm×2 cm、厚度為2 mm的且對角邊各有一個直徑為1 mm微孔的聚四氟乙烯模板框，將其兩面均涂上硅脂并置于兩片ITO玻板之間壓實，便組成了以ITO玻板為平行電極、以模板框所圍體積(約2 mL)的磷脂囊泡電形成腔，通過模板框的微孔向系統中間注入水性溶液，并通過波函數發生器向平行電極施加一定的弱交變電場，培育一段時間即可得到尺寸在微米級的磷脂巨型囊泡群。

向磷脂囊泡溶液中加入定量的熒光納米顆粒水溶液，室溫培育一段時間后在熒光顯微鏡下觀察兩者的相互作用過程，判斷熒光納米顆粒的成像效果。

2 結果與討論

2.1 熒光納米顆粒合成機理及基本性能

改進St?ber法制備熒光SiO2的原理如圖1所示。首先根據FITC分子上的異硫氰基可以和硅烷偶聯劑APTES上的氨基進行反應的特點，將其共價偶聯于硅烷分子上，得到FITC-APTES熒光前驅體；而后該前驅體通過與TEOS共水解從而將熒光基團接枝于納米SiO2膠體網絡中；最后通過再加入一部分TEOS進行水解，將含有FITC分子的納米顆粒表面包裹起來，如此可以有效防止熒光泄漏和光漂白現象，延長熒光納米顆粒的使用時間。

圖1 FITC-APTES及熒光納米SiO2合成示意圖Fig.1 Schematic representation of the synthesis of FITC-APTES and fluorescent nano-SiO2

在其它參數不變情況下，可改變醇溶劑的種類來調控納米SiO2的粒徑，甲醇是介電常數最大的且粘度最小的低鏈醇[20]，相同原料配比下以其為溶劑采用St?ber法合成的納米SiO2表面Zeta電位較高，顆粒間靜電排斥力大、勢壘較高，可以有效減少顆粒間的碰撞和相互聚集，進而得到粒徑較小的納米顆粒；乙醇和異丙醇因介電常數依次降低以及粘度逐漸升高，以其為溶劑所合成的納米顆粒表面電位和勢壘相對較低，只有形成粒徑較大的顆粒才能保證其在溶液中穩定存在。如圖2所示，采用三種醇為溶劑所得的熒光納米SiO2粒徑依次為30、150和260 nm左右，其動態光散射檢測結果均表現出很好的粒徑單分散性，但在透射電鏡表征時，由于甲醇為溶劑所得的納米顆粒粒徑較小，表面能較大，因而在干態下呈現出一定程度的團聚，而乙醇和異丙醇為溶劑所制得的熒光納米SiO2則表現出很好的球形度和尺寸均勻性。

圖2 不同醇為溶劑下合成的熒光納米SiO2透射電鏡(TEM)圖及動態光散射圖Fig.2 TEM images and dynamic light scattering diagrams of fluorescent nano-SiO2 synthesized in different alcohol solvents(a) methanol;(b) ethanol;(c) isopropyl alcohol.

在進行透射電鏡測試的同時，也采用激光共聚焦顯微鏡對熒光納米顆粒的熒光性能進行測試。由于甲醇為溶劑所合成的熒光納米SiO2粒徑太小，已經超出了激光共聚焦顯微鏡的分辨率下限(約150 nm)，未能得到清晰有效的影像；而用乙醇和異丙醇為溶劑的熒光納米SiO2則在490 nm波長激發下發射出了清晰飽滿的綠色熒光(圖3)。熒光納米顆粒分散性較佳，且粒徑與透射電鏡測試值基本吻合，表明采用改進St?ber法合成熒光納米顆粒較為成功。

圖3 乙醇(a)和異丙醇(b)為溶劑合成的熒光納米SiO2激光共聚焦顯微鏡測試圖Fig.3 Laser confocal microscopy images of fluorescent nano-SiO2 synthesized in ethanol(a) and isopropyl alcohol(b)

為判斷FITC分子的熒光性能是否會因為包覆于SiO2膠體網絡中而發生改變，又采用熒光光譜儀對比分析了前驅體FITC-APTES與三種熒光納米顆粒的激發和發射光譜(圖4)。由圖可見，納米顆粒中熒光染料的激發光譜與發射光譜與游離態FITC-APTES相比僅出現了微小的移動，應該是SiO2膠體網絡與包覆于其中的FITC分子的相互作用而致，相較來說FITC整體的熒光特性基本保持完整。除此之外，還可以明顯發現對于相同質量濃度的熒光納米顆粒，其在熒光激發光譜和發射光譜的強度上均表現出了明顯的粒徑相關性，即甲醇為溶劑合成的最小粒徑的熒光納米顆粒熒光性最強，隨著粒徑逐漸增大，熒光納米顆粒的熒光性依次減弱，出現該現象的原因應該在于相同質量濃度下，納米顆粒粒徑越小，單位體積溶液中熒光納米顆粒的個數就越多，比表面積也越大，包覆于熒光納米顆粒中的FITC分子的熒光性能表現的也就越充分；隨著納米顆粒粒徑增大，單位液體體積內納米顆粒個數減少，納米顆粒的表面效應會相應減弱，從而導致熒光性能出現了一定程度的下降。

圖4 FITC-APTES及三種熒光納米SiO2的激發和發射光譜Fig.4 Excitation and emission spectra of FITC-APTES and three fluorescent nano -SiO2

2.2 熒光納米顆粒的光穩定性

為驗證熒光納米顆粒在水溶液中的光穩定性，對FITC-APTES和三種熒光納米顆粒樣品的水溶液用熒光光譜儀400 W氙燈照射90 min，每10 min測量一次熒光強度，以四種熒光樣品各自起始的熒光強度作為基準，對比各樣品熒光強度隨照射時間的變化率，結果見圖5。由圖5可見，在強光照射一段時間后，幾種熒光樣品均表現出了一定程度的熒光衰減，不同的是處于游離態的FITC-APTES熒光衰減很快，在90 min照射后熒光強度就下降了53.96%，而其它三種熒光納米顆粒光強的下降則小的多，甲醇為溶劑合成的粒徑較小的熒光納米顆粒光強下降了18.51%，乙醇及異丙醇為溶劑合成的樣品熒光強度分別下降了12.61%和9.92%。粒徑越大的樣品熒光強度保護的越好，應該是粒徑越大，包埋在SiO2膠體網絡中的熒光分子比例越高，殼層的存在不僅可以有效防止溶解在水中的少量氧進入微球內部而造成光氧化，也可以對外界的強光進行一定程度的遮蔽。需要指出的是，雖然粒徑較小的甲醇樣品在強光照射下熒光損失較其它兩種納米顆粒的熒光損失稍高，但其本身的熒光強度依然高于其它兩種樣品，而且由于粒徑較小，其存儲穩定性更是優異，該樣品在室溫靜置狀態下存放6個月依然清澈透明，未出現沉降現象，而另外兩個樣品存放兩周后就出現了不同程度的沉降。鑒于甲醇為溶劑所制備的熒光納米SiO2優異的熒光強度保持能力以及儲存穩定性，后續實驗選用該樣品進行磷脂巨型囊泡的成像研究。

圖5 FITC-APTES及三種熒光納米SiO2的光穩定性實驗結果Fig.5 Photostability experiment results of FITC-APTES and three fluorescent nano -SiO2

2.3 熒光納米顆粒用于磷脂巨型囊泡成像

按照電形成工藝制備出磷脂巨型囊泡群后，將熒光納米顆粒水溶液加入囊泡溶液中，熒光納米顆粒濃度控制在0.5 mg/mL，利用熒光顯微鏡進行觀察，分析熒光納米顆粒與磷脂囊泡的相互作用。圖6呈現了兩者初始接觸、培育10 h和培育24 h的熒光顯微鏡測試圖，以及對應的微分干涉相襯(Differential Interference Contrast，DIC)圖片。由圖6(a)可見，當熒光納米顆粒與巨型囊泡初始接觸時，囊泡在熒光顯微鏡下呈現出較清晰的黑色影像，原因應該是熒光納米顆粒加入時囊泡的封閉結構已經形成，熒光納米顆粒初始時幾乎全部處于囊泡外，囊泡內部沒有熒光納米顆粒，因而僅呈現出黑色輪廓；隨著接觸時間延長，出現了囊泡黑色影像逐漸減弱的現象。當兩者接觸10 h后(圖6(b))，在熒光顯微鏡下幾乎看不到囊泡的輪廓了，應該是在兩者接觸過程中，磷脂囊泡逐漸將一部分熒光納米顆粒包覆于其內腔中，囊泡內部熒光納米顆粒的濃度與外界游離的熒光納米顆粒的濃度基本相同時，內外的熒光強度基本相當，囊泡無法有效成像；隨著培育時間延長，熒光納米顆粒在囊泡中不斷進入和積累，內部的熒光強度明顯高于外部。接觸24 h后(圖6(c))，已經可以觀察到明亮清晰的囊泡影像?？梢娊柚鸁晒饧{米顆粒不僅可以實現磷脂巨型囊泡成像，還可以間接揭示兩者的相互作用過程。

根據熒光顯微鏡的觀察結果，初步推斷熒光納米顆粒與磷脂巨型囊泡的相互作用過程如圖7所示。磷脂囊泡的雙分子層會因其外表面的熒光納米顆粒的吸附而發生變形，進而逐漸將納米顆粒吸收于其內腔中，過程類似于活細胞的“內吞”過程[21]。

圖7 磷脂巨型囊泡與熒光納米SiO2相互作用示意圖Fig.7 Schematic diagram of the interaction between phospholipid giant vesicles and fluorescent nano-SiO2

為了驗證所作出的熒光納米顆粒與磷脂巨型囊泡的相互作用機理推測，通過透射電鏡在低加速電壓(75 kV)下對體系進行觀察，雖然大量的囊泡在電鏡測試環境下已經破裂或融合，但仍然觀察到了囊泡內包熒光納米顆粒的過程(圖8)，(a)圖顯示出一個亞微米級別囊泡表面變形及熒光納米顆粒進入囊泡內腔的現象，(b)圖則表現出一個微米級巨型囊泡內部已經有了一定比例的熒光納米顆粒，該檢測結果間接證明了磷脂巨型囊泡這種類細胞對吸附于其表面的納米顆粒具有一定的吸收和包載能力。

圖8 熒光納米顆粒進入磷脂巨型囊泡內腔透射電鏡(TEM)圖Fig.8 TEM images of fluorescent nanoparticles entering the cavity of phospholipid giant vesicle

3 結論

采用簡單的改進St?ber法，制備出了不同粒徑的熒光納米SiO2顆粒，發現粒徑對納米顆粒的熒光強度和光穩定性均具有明顯的影響。粒徑越小納米顆粒熒光強度越強，但粒徑較大的納米顆粒則因為可以對包載于其內部的熒光分子有較好的遮蔽效果而表現出較好的抗光漂白能力。該類熒光納米SiO2顆粒由于具有較好的生物相容性，可以用于類細胞磷脂巨型囊泡成像，成像過程即是熒光納米顆粒在囊泡內部的逐步聚集過程，當磷脂囊泡將熒光納米顆粒吸收入其內部并使內部空間的熒光納米顆粒密度高于囊泡外游離的熒光納米顆粒密度時，即可獲得較好的成像效果。