高效液相色譜法測定蘋果和西紅柿中腈菌唑對映體含量

張天賜， 鐘 慧， 雙亞洲， 曾慶麗， 李 良， 李來生*,2

( 1.南昌大學化學學院，江西南昌 330047；2.南昌大學分析測試中心，江西南昌 330047)

手性農藥通常只有一種對映體能高度匹配蛋白質等生命物質的立體結構，顯示出很高的農藥活性，而其余沒有活性的對映體往往很難被生物降解，并且可以通過環境和食物鏈在生物體中廣泛傳遞，對人類的生活和生殖健康帶來深遠的影響，故生物體內手性農藥對映體的選擇性效應已引起國際社會高度關注[1]。腈菌唑(Myclobutanil，圖1)，化學名稱是2-(4-氯苯基)-2-(1H,1,2,4-三唑-1-甲基)己腈，它能夠抑制表角甾醇的生物合成,破壞細胞膜，導致病原菌死亡，具有很強的殺菌作用，是一種農業生產中廣泛使用的三唑類手性殺菌劑，對多種農作物的白粉病、銹病、黑病、灰斑病、褐斑病具有很好的防治效果[2]。動物試驗表明腈菌唑具有急性毒性，可破壞類固醇激素影響試驗動物的繁殖能力，并引起肝細胞的損傷，已被美國環境保護署(EPA)列為潛在的人類手性致癌物[3,4]。由于各種原因，目前腈菌唑仍以外消旋體形式銷售和使用，隨著手性殺菌劑用量的增大，對映體帶來的生物毒性潛在風險加大，因此，開發有關手性農藥對映體的分析方法，對科學評估其在環境和食品中的遷移、毒性和降解行為，乃至食品安全都具有重要的意義。

圖1 腈菌唑對映體的化學結構Fig.1 The chemical structure of myclobutanil enantiomers

由于對映體的物理和化學性質幾乎相同，使得手性拆分非常困難。拆分腈菌唑的方法主要是色譜法[5 - 8]，但以高效液相色譜法(HPLC)應用居多，而成功拆分的關鍵在于選用合適的手性固定相。目前只有纖維素類和直鏈淀粉類固定相能成功拆分腈菌唑的報道。2004年Pan等[9]比較了不同衍生基的纖維素固定相在正相色譜條件下拆分腈菌唑的能力，包括苯甲?；?CTB)、4-甲基苯甲?；?CTMB)、苯氨基甲酸酯化(CTPC)和3,5-二甲苯氨基甲酸酯化(CDMPC) 4種纖維素固定相。研究發現它們的拆分能力依次為CDMPC>CTPC>CTMB>CTB。Wang等[10]分別采用含苯乙基、苯基和3,5-二甲苯基的氨基甲酸酯衍生化直鏈淀粉固定相，以含5%～10%異丙醇的正已烷作為流動相，成功地拆分了腈菌唑，分離度(RS)分別為1.49、1.47和5.73，后者占有明顯的優勢。Tian等[11]把纖維素和直鏈淀粉的3,5-二甲苯基的氨基甲酸酯衍生物分別涂覆到硅膠表面，發現纖維素類固定相對腈菌唑的拆分能力明顯優于直鏈淀粉類固定相，但需要在較低的柱溫下拆分。近年來，耐溶劑的多糖類固定相如Chiralcel OD -RH、Chiralpak AD、Lux Cellulose -1等在反相色譜條件下拆分腈菌唑的應用增多，采用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)聯用技術所分析的樣品包括水、土壤、黃瓜、草霉、蚯蚓和兔子等[12 - 16]。

環糊精類固定相是一類擁有包結作用的常用手性固定相[17]，與多糖類固定相相比，環糊精鍵合時無需大孔硅膠，鍵合方法便利，耐溶劑性能好，制備成本較低，且能在多種色譜分離模式下使用。目前，只有采用羥丙基或磺酸基β-環糊精作毛細管電泳手性添加劑成功拆分腈菌唑的報道[18,19]，尚未見采用環糊精類固定相的HPLC法拆分腈菌唑的實例。我們實驗室也曾制備系列衍生化環糊精固定相，發現它們對手性碳上含羥基的三唑農藥有拆分能力，但對不含羥基的腈菌唑沒有拆分跡象[20]。最近，又制備得到一種含苯甲酰胺連接臂的β-環糊精鍵合相(TCDP，圖2)，發現盡管它的結構簡單，卻能在短時間內完全拆分腈菌唑。為此，本文拓展環糊精類固定相在測定常見果蔬中腈菌唑對映體分析方面的新應用。環糊精類固定相更適合反相色譜，所建立的液相色譜方法簡便，定量準確，重現性好，測試成本較低，能快速監測該手性農藥的殘留，具有較好的研究意義和應用價值。

圖2 含苯甲酰胺連接臂的β -環糊精手性固定相的結構Fig.2 The structure of β -cyclodextrin bonded phase(TCDP) with benzamide spacer

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ZQ 4000/2695液相色譜-質譜聯用儀，配有2996二極管陣列檢測器和Masslynx 4.1色譜軟件(美國，Waters公司)；5600+四極桿串聯飛行時間高分辨質譜儀(美國，AB SCIEX公司)；Vario EL Ⅲ元素分析儀(德國，Elementar公司)；AW-60色譜裝柱機(美國，Haskel公司)；HR1853果汁機(飛利浦(中國)公司)；MS-3迷你振蕩器(德國，IKA公司)；HSC-12A氮吹儀(南京科捷分析儀器有限公司)；KQ-100E數控超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-16C高速離心機(上海安亭科學儀器廠)。

γ-異氰酸丙基三乙氧基硅烷購于Sigma公司；硫代水楊酸、N,N′-二環己基碳二亞胺(DCC)、1-羥基苯并三唑水合物(HOBT)購自阿拉丁試劑(上海)公司；外消旋的腈菌唑標準品(純度≥99%)購于上海農藥研究院；色譜純甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)購于美國Tedia公司；樣品前處理用的N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)和石墨化炭黑(GCB)購自博納艾杰爾科技公司(天津)；Fe3O4磁性納米粒子參考Zheng等[21]報道的方法制備；無水MgSO4、NaCl、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮和其他分析純試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司(上海)。實驗所用超純水由Milli-Q超純水制備裝置(美國Millipore公司)制備。

實驗用蘋果和西紅柿樣品從南昌市周邊市場隨機采購。

1.2 含苯甲酰胺連接臂β -環糊精鍵合相制備

有序介孔硅膠SBA-15和單6-氨基-β-環糊精分別按文獻方法[22,23]制備，SBA-15粒徑2.5～4.5 μm，比表面積約為400 m2/g。主要合成過程：將2.0 g干燥的單6-氨基-β-環糊精和0.31 g硫代水楊酸溶解在40 mL DMF中。加入0.3 g DCC和0.3 g HOBT作脫水劑，混合物在氮氣保護下室溫攪拌反應48 h。倒入丙酮至溶液后析出沉淀，用少量熱水溶解后加丙酮重新析出沉淀，固體真空干燥后得到2-巰基苯甲酰胺基-β-環糊精，產率66%。ESI([M-H]-,m/z)為1268.3854，與理論值(1268.3762)基本相同。將上步中間產物溶解于50 mL無水DMF中，加入0.3 mLγ-異氰酸丙基三乙氧基硅烷偶聯劑和3.0 g SBA-15，攪拌下95 ℃繼續反應24 h。將濾出的粗產品依次用DMF、甲醇、丙酮反復洗滌，經真空干燥后得到產物TCDP固定相。

1.3 腈菌唑標準溶液的配制

精密稱取一定量的外消旋的腈菌唑標準品，用甲醇溶解并配制100 μg/mL的儲備溶液，由于含等量的對映體，單一對映體濃度為50 μg/mL。然后分步用甲醇稀釋，得到一系列濃度梯度的外消旋腈菌唑標準溶液，單一對映體濃度范圍為0.5～50 μg/mL，用0.22 μm有機微孔相濾膜過濾后裝入進樣瓶中，超聲脫氣后進樣分析。

1.4 色譜分析條件

采用自制的TCDP為色譜固定相，用勻漿填充法裝柱(150 mm×4.6 mm)；流動相為不同體積比的甲醇-水或乙腈-水，使用前經濾膜過濾和超聲脫氣處理。首先對流動相組成和柱溫進行優化，使腈菌唑對映體能在較短時間內完全分離。實驗發現甲醇-水=20∶80(V/V)與乙腈-水=12∶88(V/V)都能完全拆分腈菌唑，但乙腈紫外吸收較弱，對檢測干擾相對較小，所以本實驗選用乙腈-水=12∶88(V/V)作為流動相，流速為0.5 mL/min。設定二極管陣列檢測器的波長范圍為200～250 nm，定量檢測波長為221 nm，柱溫設為20 ℃，進樣量為10 μL。

1.5 樣品前處理方法

根據文獻方法[21]制備Fe3O4磁性納米粒子進行提取、凈化和濃縮。釆用改進的QuEChERS方法提取果蔬中腈菌唑農藥殘留。主要步驟如下：首先將新鮮的蘋果和西紅柿樣品切片，用蔬菜搗碎機制成果漿。稱取10 g果漿樣品于50 mL的Eppendorf塑料管中，加入10 mL乙腈，渦旋勻漿。然后加入4.0 g無水MgSO4和1.0 g NaCl，再次渦旋，防止結塊。在5 000 r/min下離心10 min，并將上層清液轉移至一支預裝有1.0 g無水MgSO4的Eppendorf塑料管中，渦旋處理后靜置，取上清液1.0 mL加入到一支2 mL 的離心管中(管中預裝有50 mg PSA，40 mg GCB和60 mg Fe3O4磁性納米粒子)，用力振搖，通過外部磁鐵快速澄清，收集清液。清液經氮吹后用少量甲醇復溶，用0.22 μm濾膜過濾后，進樣分析。

2 結果與討論

2.1 含苯甲酰胺連接臂β -環糊精鍵合相的鍵合量

TCDP固定相經60 ℃真空干燥12 h后進行元素分析，兩次平均結果為：C,4.88%；H,0.92%；N,0.33%?；贑含量計算出固定相的平均鍵合量約為0.194 μmol/m2。后續的實驗表明TCDP能完全拆分腈菌唑，且保留時間和分離度重現性好，表明環糊精配體已被牢固地鍵合到硅膠上，其手性分離功能滿足對映體定量分析要求。

2.2 TCDP拆分腈菌唑分離條件的優化

2.2.1 固定相與流動相的選擇對映體的結構和物理化學性質幾乎相同，手性拆分困難，為了提高拆分效率，必須優化流動相的組成。本實驗選用反相色譜分離模式，并盡量釆用簡單的流動相。實驗發現，在新型的β-環糊精柱上，常見的甲醇-水或乙腈-水可完全拆分腈菌唑，無需添加酸、堿和緩沖溶液。由于采用二極管陣列檢測器，需要在較低波長(221 nm)檢測腈菌唑，所以選用截止波長較低的乙腈-水作流動相，同時乙腈的洗脫強度比甲醇大，有利于快速分析。圖3為流動相中乙腈含量對腈菌唑分離度的影響。從圖中可以看出，隨著流動相中乙腈的體積分數從5%提高到15%，分離度先增后減；當其體積分數超過15%時，分離度迅速降低，可能是因為在反相色譜條件下，乙腈洗脫能力較強，會顯著削弱腈菌唑與環糊精配體間的包結作用力，導致手性分離度下降，選擇乙腈體積分數12%就可拆分腈菌唑。我們實驗室以前合成的一系列衍生化環糊精固定相對腈菌唑也無拆分能力[20]。最近我們制備的TCDP固定相能快速拆分腈菌唑，可能與苯甲酰胺基連接臂參與了手性識別有關。所以本文選用TCDP和乙腈-水=12∶88(V/V)分別作為固定相和流動相，建立一種測定蘋果、西紅柿果蔬中腈菌唑對映體含量的新方法，以期拓展環糊精手性固定相的應用范圍。

圖3 流動相中乙腈含量對腈菌唑對映體分離度的影響Fig.3 The effect of ACN content in mobile phases on the resolution of myclobutanil enantiomers

采用不同的流動相流速(0.3～0.8 mL/min)進行拆分，實驗發現如果流速太快，腈菌唑洗脫快，與固定相的作用力不夠，導致手性分離度低；當流速太慢，分離時間變長，還會造成峰展寬。對于15 cm的手性柱，適宜的流速為0.5 mL/min。

2.2.2 柱溫的選擇溫度能同時影響色譜中的熱力學平衡和擴散傳質動力學過程，從而影響手性分離選擇性。本實驗探討了常見溫度范圍(即15～40 ℃)對腈菌唑分離參數的影響(表1)。從表中數據可以看出，隨著柱溫的升高，溶質洗脫加快，分離度也降低(1.72～0.52)，應該與焓控制有關[24]。本文選用20 ℃作為柱溫，因為在該溫度下分析時間較短，同時能完全拆分腈菌唑。

表1 柱溫對腈菌唑對映體分離參數的影響

2.2.3 進樣量的選擇進樣量與分離度、檢出限和重現性有關。進樣量較低時，腈菌唑的檢測信號易受噪聲干擾；進樣量較高時會降低分離度。本實驗發現10 μL進樣量較合適。

2.2.4 檢測波長的選擇掃描腈菌唑標準品溶液紫外-可見光譜，實驗發現腈菌唑在221 nm有較強的紫外吸收，260 nm僅有弱的吸收，因此設置檢測波長為221 nm。

2.3 腈菌唑標準品和樣品分析

2.3.1 工作曲線與外標法定量配制外消旋腈菌唑系列標準溶液，兩對映體濃度均為0.5、2、5、10、20、50 μg/mL。從低濃度到高濃度依次進樣，按上述優化的液相色譜條件分離和檢測。在上述條件下外消旋腈菌唑標準品溶液的色譜圖如圖4所示。以腈菌唑濃度(x,μg/mL)為橫坐標，相應的峰面積(y)為縱坐標，得到兩種對映體的線性回歸方程。按出峰順序定義為對映體1和對映體2。對映體1：y1=211.25x1+70.28，r1=0.9992；對映體2：y2=203.74x2+69.13，r2=0.9981。

圖4 流動相為乙腈-水(12∶88,V/V)時外消旋腈菌唑標準品溶液的色譜圖Fig.4 Chromatogram of racemic myclobutanil standard by using acetonitrile-water(12∶88,V/V) as mobile phase(23.52 min and 25.67 min for myclobutanil enantiomers)

在同樣的條件下，對前處理好的樣品溶液進行測定，按外標法定量，并考慮前處理步驟的濃縮倍數。結果表明腈菌唑兩對映體在0.5～50 μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。按信噪比(S/N=3)推算出每個對映體最低檢出濃度為0.04 μg/mL。

2.3.2 回收率試驗分別向蘋果和西紅柿的陰性樣品中添加外消旋腈菌唑標準品進行回收試驗，單個對映體的濃度為5 μg/mL和10 μg/mL，每個樣品連續測定5次，根據測得量的平均值與加入量之比計算平均回收率，見表2。從表中數據可知，該方法腈菌唑對映體有較高的回收率，蘋果中所測得的兩對映體的平均回收率分別為93.62%和93.34%，西紅柿中所測得的兩對映體的平均回收率分別為95.43%和94.80%。上述樣品測定的相對標準偏差(RSD，n=5)為1.27%～2.01%，表明測定結果具有良好的重現性。添加外消旋腈菌唑的蘋果(a)和西紅柿(b)樣品的色譜圖見圖5。

表2 蘋果和西紅柿中腈菌唑對映體的平均回收率(n=5)

圖5 分別添加外消旋腈菌唑的蘋果基質(a)和西紅柿基質(b)的色譜圖Fig.5 Chromatograms of spiked apple sample(a) and tomato sample(b) with racemic myclobutanil standard,respectively(23.40 - 25.65 min for myclobutanil enantiomers)

2.3.3 實際樣品分析從市場上隨機購買一批蘋果和西紅柿各15件作為樣本。按照“1.5”方法進行前處理，根據“1.4”的高效液相色譜方法分離和測定腈菌唑對映體含量，每個樣品重復測定3次，并將3次的平均值用作檢測結果。尚未發現含腈菌唑的陽性樣品。

3 結論

釆用自制的含苯甲酰胺連接臂的β-環糊精手性固定相(TCDP)，以乙腈-水作流動相，實現了腈菌唑對映體的完全分離，并建立了一種測定蘋果和西紅柿中腈菌唑對映體含量的新方法。TCDP結構簡單，制備方法便利，采用環糊精類固定相首次成功地拆分腈菌唑，為該手性農藥的有效拆分提供了一種新型的分離材料，為將來其在食品安全分析中的實際應用創造了條件。