piggyBac轉座子AgoPLE1.1在黑腹果蠅種系轉化中的應用

張浩淼, 王曉芳, 羅光華, 韓湘豫, 王秋霞, 韓召軍, 吳 敏,*

(1. 南京農業大學植物保護學院, 南京 210095; 2. 江蘇省農業科學院植物保護研究所, 南京210014)

在轉基因研究中發揮重要作用的DNA轉座子有果蠅Drosophila的P因子、Tc1/Mariner家族的Minos、hAT家族的Hermes、Mariner家族的Mos1和piggyBac轉座子(PB)家族的IFP2。研究表明，果蠅P因子在天然宿主以外的生物中沒有活性(O′Brochta and Atkinson,1996)；Tc1/Mariner家族轉座子不僅轉座頻率較低(Drabeketal., 2003)，并且其攜帶外源基因的能力有限(Dingetal., 2005)；Hermes因子轉化整合完整基因的精確度和可靠性有問題(Sarkaretal., 1997)。只有PB家族的IFP2因子，不但能夠在生物染色體中精確地剪切和轉座，能夠攜帶較大的外源基因，而且具有廣泛的適用范圍。事實證明，PB轉座系統不僅在半翅目、鞘翅目、鱗翅目、雙翅目和膜翅目的幾十種昆蟲中實現了種系轉化，而且在真渦蟲、瘧原蟲、斑馬魚、大鼠、豬、人和小鼠等哺乳動物細胞體內也實現了高效轉化(Handleretal., 1998; Horn and Wimmer, 2000; Loboetal., 2006; Carotietal., 2015)。由于PB轉座系統的安全高效，該系統在細胞免疫療法中顯示出巨大的潛力，正在開發針對多種人類疾病的相關細胞，如人體誘導多功能干細胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)和人T細胞等的修飾(Kajietal., 2009; Nakazawaetal., 2009; Wangetal., 2018)；此外PB轉座系統可以與靶向基因編輯技術CRISPR/Cas9結合，提高CRISPR/Cas9系統所敲入基因的持續表達能力(Chenetal., 2015; Chengetal., 2016)。綜上所述，PB轉座系統是一個非常具有應用潛力的轉基因工具。

PB轉座子最初是從粉紋夜蛾Trichoplusiani中分離得到的真核生物DNA轉座子。經基因組序列分析和同源基因克隆發現，PB轉座子廣泛分布于真菌、植物、尾索動物、甲殼動物、昆蟲、魚類、兩棲動物以及哺乳動物等生物的基因組中(Sarkaretal., 2003)。由于受宿主選擇壓的作用，PB轉座子大部分已經發生了不同程度的變異，但仍有部分保留著完整結構與轉座酶活性，甚至轉座活性。Hikosaka等(2007)在爪蟾Xenopustropicalis中發現了一個具有天然剪切活性的TxpB_Uribo2因子；我們在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、銀錠夜蛾Macdunoughiacrassisigna、小地老虎Agrotisypsilon和棉蚜Aphisgossypii中也發現了大量的PB類似因子，其中有些因子，例如棉蚜的AgoPLE1.1，不僅結構完整，而且可以在果蠅S2細胞中進行精確的剪切(Sunetal., 2008; Wuetal., 2008, 2011; Luoetal., 2011)。本研究在前期研究的基礎上，擬通過系列試驗闡明AgoPLE1.1因子在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中的轉化活性及其轉座特點，探討該PB類似因子AgoPLE1.1開發為新型昆蟲轉基因載體的可能性。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

黑腹果蠅W1118品系由東南大學發育與疾病相關基因實驗室提供。黑腹果蠅用由玉米粉 50 g/L、酵母粉25 g/L、蔗糖110 g/L和瓊脂4 g/L做成的人工飼料飼養，實驗室飼養條件為溫度25±2℃，相對濕度60%～70%，光周期16L∶8D。

1.2 供試試劑

LA Taq DNA聚合酶, dNTP, DNA Marker和Genome Walking試劑盒都購自寶生物工程(大連)有限公司；凝膠純化試劑盒購自Axygen公司；質粒小提試劑盒購自Omega公司；無內毒素質粒提取試劑盒購自Qiagen公司；pEASY-T3 Cloning Kit和感受態細胞Trans5α購自北京全式金公司；限制性內切酶購自Thermo公司; T4連接酶購自Promega公司；地高辛雜交檢測試劑盒Ⅱ(化學發光法)購自Roche公司。

1.3 轉基因載體構建

將質粒pBacHsp(由美國加州大學河邊分校T.A.Miller教授惠贈)用ApaⅠ和Pf123Ⅱ進行雙酶切去除IFP2轉座酶序列，在AgoPLE1.1轉座酶序列兩端加上ApaⅠ和Pf123Ⅱ酶切位點后與去除IFP2轉座酶的pBacHsp載體骨架相連接，構成輔助質粒pAgoHsp。 通過PCR擴增將載體pXLBacII-PubDsRed(由美國農業部Alfred M.Handler惠贈)上的IFP2的末端反向重復序列(ITR)替換成AgoPLE1.1轉座子的ITR序列，構建供體質粒pXLAgo-PUbDsRed。PCR反應體系: 10×LA Taq Buffer 5 μL, 上下游引物(10 pmoL)各2.5 μL, dNTP Mixture 8 μL, 模板DNA 200 ng, TaKaRa LA Taq DNA聚合酶0.5 μL, 無菌水補足50 μL。PCR程序: 94℃預變性1 min; 98℃變性 10 s, 68℃退火 15 s, 72℃延伸2 min, 共30個循環; 72℃ 10 min, 12℃保持。載體構建引物見表1。分別提取無內毒素的輔助質粒和供體質粒DNA，置于-20℃備用。

1.4 黑腹果蠅的顯微注射

顯微注射的方法參考Spradling和Rubin(1982)。 用1.3節構建好的輔助質粒pAgoHsp和供體質粒pXLAgo-PubDsRed DNA分別以170 ng/μL∶400 ng/μL, 90 ng/μL∶200 ng/μL和90 ng/μL∶100 ng/μL的濃度進行混合，分別注射1 083, 1 000和1 023粒新鮮的W1118黑腹果蠅胚胎。將注射完成的胚胎放入培養箱。經6～24 h培養后，把孵化出的幼蟲轉移至培養瓶中飼養。每頭羽化出的成蟲分別與W1118黑腹果蠅回交，挑取后代中發出紅色熒光的個體即為轉基因黑腹果蠅。

1.5 Southern雜交

以供體質粒pXLAgo-PubDsRed DNA為模板，在其3′端設計上游引物和下游引物進行PCR擴增。PCR反應體系: 2×PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL, 上下游引物(10 pmoL)各1 μL, 模板DNA 200 ng, 無菌水補足25 μL。PCR程序: 94℃預變性5 min; 94℃變性 30 s, 52℃退火 30 s, 72℃延伸40 s, 共35個循環; 72℃ 10 min, 12℃保持。獲得573 bp DNA片段的純化PCR產物。以純化后的573 bp DNA片段為模板，根據地高辛探針合成試劑盒步驟合成DNA探針。提取黑腹果蠅3個轉基因株系F1, F2和F3的基因組DNA，將10 μg基因組DNA用限制性內切酶EcoRV完全酶切后用等體積酚∶氯仿抽提純化，進行Southern雜交檢測，以供體質粒pXLAgo-PubDsRed DNA作為陽性對照。用化學發光檢測系統掃描發光信號，曝光時間為3 h，記錄實驗結果。

1.6 轉座子插入位點旁側序列的PCR擴增

為了獲得AgoPLE1.1轉座子在黑腹果蠅基因組中插入位點的旁側序列，采用染色體步移技術根據供體質粒pXLAgo-PubDsRed序列設計特異引物(表1)。以轉基因果蠅基因組DNA為模板，以Genome Walking試劑盒中提供的兼并引物與特異引物進行熱不對稱PCR反應，通過3次巢式 PCR 擴增即可獲取AgoPLE1.1轉座子插入位點的序列，將克隆的旁側DNA序列送至公司進行序列測定后利用Genedoc軟件與供體質粒pXLAgo-PubDsRed序列進行比對分析，去除載體序列后在Flybase數據庫中進行BLAST比對，明確AgoPLE1.1轉座子插入位點所在的黑腹果蠅的染色體。

表1 本研究所用引物

2 結果

2.1 AgoPLE1.1在黑腹果蠅中的轉化

將供體質粒pXLAgo-PubDsRed和輔助質粒pAgoHsp以400 ng/μL∶170 ng/μL, 200 ng/μL∶90 ng/μL和100 ng/μL∶90 ng/μL 3種不同的濃度混合，分別注射了1 083, 1 000和1 023粒新鮮W1118黑腹果蠅胚胎，3組胚胎分別孵化并羽化出成蟲(G0)155, 151和234頭；將羽化的每一頭成蟲分別單獨與W1118黑腹果蠅回交，3組中分別有138, 130和146對回交產生了后代(G1)，可育率分別是89.03%, 86.09%和62.39%。；3組可育后代中各篩選到1株轉基因果蠅，它們分別被命名為F1(2♂+1♀), F2(1♂+1♀)和F3(1♂+3♀)。這3個株系(F1, F2和F3)及其后代果蠅可在激發光波長下產生紅色熒光(圖1)。因此，AgoPLE1.1轉座子可以在黑腹果蠅中進行種系的轉化，3次轉化實驗的轉基因頻率分別為1.94%, 1.32%和1.71%。

圖1 AgoPLE1.1轉座子轉化的轉基因黑腹果蠅

2.2 AgoPLE1.1轉座子在黑腹果蠅染色體中的插入

Southern雜交結果表明，探針在陽性對照樣品中雜交獲得一條大小為7 kb左右的條帶，與供體質粒pXLAgo-PubDsRedDNA 7 155 bp的大小相符；3個轉基因株系(F1, F2和F3)的果蠅各檢測到3個清晰的雜交條帶，F1和F2有一條大小一致的4.3 kb條帶，F2和F3有兩條大小一致的6.5和8.5 kb雜交條帶(圖2)。因此，3個株系的雜交條帶一共有6個，大小分別為3.9, 4.3, 6.5, 7.2, 8.5和9.4 kb，說明AgoPLE1.1轉座子在每個轉基因株系的黑腹果蠅中至少有3個插入位點。

圖2 AgoPLE1.1轉座子轉化的轉基因黑腹果蠅的Southern雜交分析

2.3 AgoPLE1.1轉座子插入位點旁側序列

為了進一步驗證AgoPLE1.1轉座子在黑腹果蠅染色體中的插入特性，我們利用染色體步移技術克隆獲得了轉基因果蠅中AgoPLE1.1轉座子插入位點的旁側序列。通過與供體質粒pXLAgo-PUbDsRed序列的比對，把轉座子供體序列與果蠅染色體序列進行區分，并將染色體序列在Flybase數據庫中進行BLAST比對。結果表明，F1株系中AgoPLE1.1轉座子插入黑腹果蠅3R和2L染色體，F2株系中AgoPLE1.1轉座子插入3L和2L染色體，F3株系中AgoPLE1.1轉座子插入3L和X染色體。其次，插入位點的旁側序列表明，AgoPLE1.1轉座子在黑腹果蠅中的剪切和轉座是非精確的，與精確剪切相比，3個轉基因株系的AgoPLE1.1轉座子插入果蠅染色體時5′端缺失了256～612 bp不等，3′端整合了210～800 bp不等的供體質粒序列(圖3)。

圖3 AgoPLE1.1轉座子插入黑腹果蠅染色體位點序列分析

3 討論

AgoPLE1.1轉座子是在棉蚜基因組中克隆的PB類似因子，AgoPLE1.1編碼完整的轉座酶并具有17 bp的末端反向重復序列(Luoetal., 2011)。前期的研究表明AgoPLE1.1轉座子具有開發為昆蟲轉基因載體的潛力，本研究率先在黑腹果蠅中檢測其轉化活性。根據本實驗室顯微注射果蠅胚胎的經驗：輔助質粒和供體質粒不同的比例和濃度會影響DNA轉座子在宿主體內的轉化頻率。因此，本研究將輔助質粒pAgoHsp和供體質粒pXLAgo-PubDsRed的DNA以170 ng/μL∶400 ng/μL, 90 ng/μL∶200 ng/μL和90 ng/μL∶100 ng/μL 3個不同的濃度比例進行混合，并分別注射黑腹果蠅胚胎。結果表明，AgoPLE1.1轉座子在黑腹果蠅中具有種系轉化的活性，轉化頻率為1.32%～1.94%；AgoPLE1.1轉座子在黑腹果蠅染色體中的插入拷貝數大于等于3個；插入位點旁側序列揭示AgoPLE1.1轉座子在黑腹果蠅中的剪切和轉座是非精確的，不僅整合了供體質粒的部分骨架，還缺失了AgoPLE1.1轉座子5′端部分的序列。該結果與AgoPLE1.1轉座子在果蠅S2細胞中精確剪切的試驗結果(Luoetal., 2011)不一致。原因可能是AgoPLE1.1 轉座子在不同的細胞環境和活體環境中時，AgoPLE1.1轉座酶活性產生差異，轉座酶對靶位點的識別作用會有不同，以及酶的剪切活性也會發生變化，從而導致AgoPLE1.1轉座子的轉座行為發生改變。據此推測，AgoPLE1.1轉座子可能具有較強的宿主因子的依賴性。

因此，與普遍應用的PB轉基因載體IFP2相比，AgoPLE1.1轉座子不能夠像IFP2那樣在活體昆蟲中進行“無縫切除”(Handleretal., 1998)，它不僅會攜帶有供體質粒DNA序列，而且轉座子自身序列會產生不確定的缺失；其次，AgoPLE1.1轉座子在黑腹果蠅中的轉化頻率遠低于IFP2在黑腹果蠅中的26%(Handler and Harrell, 1999)，AgoPLE1.1轉座子可能有較強的宿主因子依賴性?；谏鲜鎏卣鞯谋容^得出結論：AgoPLE1.1轉座子不具有進一步開發為高效的昆蟲轉基因載體的潛力，但是其在棉蚜體內仍然保留有轉座活性的特點引起對PB轉座系統的穩定性和安全性的思考。已有文獻報道：hAT家族的hobo轉座子能夠與類似因子Hermes和Homer產生交互作用，引起轉基因的不穩定現象(Sundararajanetal., 1999; Raphaeletal., 2004)。由于PB轉座子及其類似因子廣泛地存在于諸多生物體中，除了本研究已報道的活性因子AgoPLE1.1，Hikosaka等(2007)報道的爪蟾Xenopus中的一個具有天然剪切活性的TxpB_Uribo2因子外，Wu等(2011)還報道了一個IFP2高度類似因子McrPLE也具有剪切活性。這些報道只是眾多活性PB類似因子的冰山一角，盡管這些內源PB轉座子的轉座活性較低，但是在應用PB轉座系統進行基因操作時，這些具有活性的內源性PB類似因子也有可能對PB轉座系統介導的外源基因進行切除或轉移，使轉基因產生不確定的變異。因此，PB轉座系統和PB活性類似因子之間的交互識別作用是急需研究和解決的一個科學問題。