乳牙與恒牙牙髓干細胞成血管能力的比較

黃小亞 鄭雷蕾 李彩玉 劉東蓉 趙梓藝 胡赟

近年來利用牙源性干細胞再生牙髓進行了大量的研究，牙髓干細胞來源于牙髓，作為種子細胞運用于牙髓再生，具有天然的優勢。根據發育時間不同，牙髓干細胞可分為乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth cells,SHED)[1]和恒牙牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)[2],盡管有大量關于牙髓干細胞的研究，但目前大多數的研究聚焦于牙髓干細胞一般生物學特性及礦化能力的研究[3-5]，對乳牙和恒牙牙髓干細胞成血管能力的研究報道相對較少[6]，兩者成血管能力的差異未見報道。故本實驗擬探究乳牙和恒牙牙髓干細胞成血管能力的差異，進而為牙髓再生的治療方法提供實驗依據及新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

納入2019 年4 月～2019 年12 月重慶醫科大學附屬口腔醫院10 例5～10 歲健康兒童因乳牙滯留拔除的乳牙樣本以及10 例15 歲以下健康青少年正畸治療拔除的前磨牙樣本。樣本收集征得患者及家屬知情同意并獲得倫理委員會批準。

L-DMEM培養基(Hyclone，美國)；血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)(Pretech，美國)；胎牛血清(FBS)(Natocor，阿根廷)；CCK8試劑盒(同仁，日本)；Matrigel膠(BD，美國)；Trizol Reagent(Invitrogen，美國)；RT-PCR試劑盒(Promega，美國)；兔抗人CD31抗體(Abcam，英國)；兔抗人GAPDH抗體(CST，美國)；羊抗兔IgG抗體(上海碧云天)；超凈工作臺、細胞培養孵箱(Thermo，美國)；倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 SHED、DPSCs的分離培養

無菌條件下分別取出各個牙齒的牙髓組織，用酶消化法(4 mg/ml中性蛋白酶和3 mg/mlI型膠原酶按1∶1比例混合)獲取細胞常規原代培養，培養3 d半量換液，之后2～3 d換液1 次，當細胞生長達到70%～80%融合時，消化后傳代培養至P3用于后續實驗。

1.3 CCK-8檢測SHED、DPSCs的增殖

采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)測定細胞生長曲線。取第3代SHED和DPSCs按2×104個/孔的密度接種于96 孔板中，L-DMEM培養液常規培養，每2 天換液1 次，按每日分7組，每組3 個復孔，每天同一時間取一組細胞加入10 μL的CCK-8溶液于37 ℃、5%CO2孵箱中避光孵育4 h后，用酶標儀測定在450 mm波長處的吸光度A450，記錄連續測定7 d的結果。

1.4 劃痕實驗檢測SHED、DPSCs的遷移

預先用Maker筆在6 孔板背面畫線標記，取對數生長的P3代SHED和DPSCs消化后，按5×105個/孔的密度接種于6 孔板，細胞長滿板底后，用200 μL的槍頭制作直線劃痕，吸棄培養液，用PBS洗去劃痕產生的細胞碎片，加入含1%FBS的L-DMEM培養液，放入孵箱中培養，于0、12、24 h取出在倒置相差顯微鏡下拍照觀察劃痕愈合情況。

1.5 體外成血管誘導

選取對數期生長的P3代SHED、DPSCs，按1×105個/孔的密度接種于6 孔板中，常規培養液(L-DMEM培養基：1%雙抗，10%FBS)培養24 h待細胞完全貼壁融合后，將培養液更換為成血管誘導液[L-DMEM培養基：10%FBS，1%雙抗，10 μg/L堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，0.1 mg/L地塞米松，50 μg/L血管內皮生長因子(VEGF)，2 g/L牛血清白蛋白(BSA)]，2 d換液1 次。

1.6 Matrigel小管形成實驗

將Matrigel膠置于4 ℃冰箱內過夜融化，移液槍頭、96 孔板等置于-20 ℃冰箱內過夜預冷。在超凈臺中將96 孔板平放于冰盒中，每孔緩慢加入50 μL Matrigel膠，注意不能有氣泡，將加好Matrigel膠的96 孔板放入37 ℃、5%CO2孵箱中孵育30 min。取SHED、DPSCs成血管誘導14 d的細胞消化離心后，重懸于成血管誘導液，以4×104個/孔的密度接種于上述96 孔板中，放入孵箱中培養，于2、4 h時取出在倒置相差顯微鏡下拍照觀察小管形成情況。

1.7 RT-PCR檢測CD31、VEGF、EphB4、EphrinB2、vWF mRNA的表達

引物由生工生物工程(上海)有限公司設計合成(表 1)，Primer blast驗證引物質量。兩種細胞成血管誘導培養5、7、14 d，Trizol試劑盒提取各組細胞總RNA后測定濃度,Promega GoScript反轉錄系統進行逆轉錄合成cDNA。采用SYBR Green試劑盒進行RT-PCR檢測，反應體系20 μL，實時熒光定量 PCR 儀檢測并記錄數據。

表 1 RT-PCR引物序列表

1.8 Westem blot檢測CD31蛋白的表達

兩種細胞成血管誘導培養7、14 d，提取各組細胞總蛋白，BCA濃度試劑盒測蛋白濃度。上樣后SDS-PAGE凝膠電泳分離,轉蛋白至PVDF膜, 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加一抗CD31、GAPDH(1∶1 000稀釋) 4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3 遍，二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜3 遍，化學發光法顯影。

1.9 統計學方法

2 結 果

2.1 SHED、DPSCs細胞形態觀察

乳牙和恒牙來源的牙髓組織塊培養3～7 d，可見成纖維樣細胞從組織團塊邊緣爬出，10～14 d左右細胞達70%～80%融合。SHED和DPSCs傳代培養至P3，鏡下觀察到，SHED生長呈放射狀或渦旋狀，多數為長梭形，少數為多角形；DPSCs形態多樣，有梭形和多角形等形狀(圖 1)。

圖 1 SHED、DPSCs細胞形態(×40)

2.2 SHED、DPSCs的生長曲線比較

CCK8結果顯示，兩種細胞接種后1～4 d穩定生長，從第5天開始進入對數生長期，無明顯平臺期。從第5天開始到第7天，SHED的A值顯著高于DPSCs,差異具有統計學意義(P<0.05)，表明SHED的增殖能力強于DPSCs(圖 2)。

圖 2 SHED、DPSCs的增殖曲線

2.3 SHED、DPSCs的遷移能力比較

通過拍照比較兩種細胞的遷移率，在12、24 h時可見SHED遷移率顯著高于DPSCs(圖 3)，表明SHED的遷移能力強于DPSCs。

圖 3 SHED、DPSCs劃痕實驗結果(×40)

2.4 SHED、DPSCs體外成血管能力比較

將成血管誘導14 d的兩種細胞接種于Matrigel基質膠上孵育2 h后，倒置相差顯微鏡下均可見細胞相互連接形成類血管樣結構，4 h后細胞胞體開始收縮見類血管樣結構逐漸開始瓦解，通過ImageJ半定量分析，誘導后的SHED形成的血管網眼數、節點數、節段數均高于誘導后的DPSCs(圖 4)。

圖 4 SHED、DPSCs誘導后的Matrigel小管形成驗(×40)

2.5 成血管相關基因及蛋白的表達

RT-PCR結果表明，第5、7、14天SHED較DPSCs更高表達CD31、VEGF、EphB4(P<0.05)；第5天和第7天，EphrinB2在SHED中更高表達(P<0.05)；第14天，SHED較DPSCs更高表達vWF(P<0.05)(圖 5)。WB結果顯示，第7天和第14天SHED的CD31蛋白表達量均高于DPSCs，與基因表達趨勢一致。

圖 5 CD31、VEGF、EphB4、EphrinB2、vWF mRNA及CD31蛋白的表達

3 討 論

年輕恒牙常因外傷、齲病和發育畸形等原因導致牙髓壞死或根尖周炎，傳統的治療方法為根尖誘導成形術或根尖屏障術，但兩種方法均有一定的劣勢，治療后的患牙牙根停止發育，根管壁薄而脆，易出現再感染、根折和牙齒脫落等并發癥[7]。隨著組織工程與再生醫學技術的發展，基于干細胞的牙髓再生有望再生受損的牙本質和功能性牙髓，恢復患牙的天然功能。組織工程三大要素即干細胞、支架和生長因子，此外血供也極其重要[8]。SHED和DPSCs起源于神經嵴細胞，具有間充質干細胞的自我更新、克隆形成及多向分化等特點[9]。同時SHED和DPSCs位于血管周圍的生態位，一方面可以旁分泌多種血管生成調節蛋白，另一方面在特定微環境下可以分化成血管內皮細胞，從而促進血管生成[10]。

雖然SHED和DPSCs都來源于牙髓組織, 但在增殖速率、分化潛能、基因表達譜等方面存在諸多差異[4]。本課題組前期的實驗研究發現SHED較DPSCs相比具有更強的成牙本質分化能力[11]，此外本實驗也通過比較研究發現SHED的增殖和遷移能力均強于DPSCs，與以往研究報道一致[3]，造成這種差異的原因可能是因為SHED相比DPSCs是更不成熟的間充質干細胞[12]。SHED良好的增殖、遷移和成牙本質分化能力為促進受損牙髓組織的修復和再生提供了保障。

牙髓組織的再生主要包含神經、血管、牙本質的再生，牙髓干細胞具有促進血管生成的作用，是一種運用于牙髓再生的優秀種子細胞。有研究將人DPSCs接種于牙薄片或支架上，移植到免疫缺陷小鼠皮下組織，用免疫組化和免疫熒光觀察到人DPSCs分化血管內皮細胞并形成與小鼠血管吻合的新生血管[6]，類似地將人自體SHED聚合體植入牙髓壞死的年輕恒切牙空根管中觀察到牙根繼續發育和三維全牙髓再生，組織學染色顯示再生的牙髓類似天然牙髓，含有神經、血管、成牙本質細胞、結締組織等成分[13]，說明兩種細胞參與血運重建，能有效促進血管新生，但它們成血管能力的比較未見報道。血管內皮細胞具有在基質膠上形成類血管樣結構的獨特能力，Matrigel基質膠可作為細胞增殖和遷移的支架，已被廣泛應用于檢測體外血管生成的實驗中[14]。本研究通過Matrigel小管形成實驗觀察到經成血管誘導14 d后兩種細胞均能在基質膠上形成廣泛的類血管樣結構，且SHED呈現出更明顯的類血管樣結構，表明了SHED較DPSCs具有更強的體外成血管能力。vWF是由血管內皮細胞合成的一種多聚糖蛋白，存儲在其特異性細胞器(Weibel-Palade body，W-P)中，可作為鑒定血管內皮細胞的表面標志物[15]，目前研究中常用的成血管相關因子還有CD31、VEGF、EphrinB2、EphB4。本研究的PCR和WB結果表明，SHED成血管相關基因和蛋白的表達相對高于DPSCs，提示SHED經誘導后在分子水平上更接近血管內皮細胞，從而具有更強的成血管能力。

EphrinB2主要存在于動脈內皮細胞和壁細胞，而EphB4主要存在于靜脈內皮細胞[16]。已有研究報道，剪切應力和VEGF可以誘導SHED內皮分化，當沉默EphrinB2時SHED在基質膠上形成類血管樣結構的能力受到抑制，提示EphrinB2 信號通路可能參與SHED的內皮分化過程[17]。EphrinB2是一種Eph受體的跨膜配體，能夠傳導早期血管生成重構所需的細胞信號，有研究報道EphrinB2/EphB4受體信號通路在胚胎血管發育中發揮關鍵作用[18]，但EphrinB2調控血管系統發育和功能的分子機制目前尚不清楚。

綜上所述，本研究證明了兩種牙髓組織來源干細胞均能在體外誘導分化為血管內皮細胞，且SHED相比DPSCs表現出更強的增殖、遷移和成血管能力，但SHED成血管的能力仍需體內實驗進一步驗證以及成血管相關分子機制將在后續實驗中深入研究。此外SHED具有來源豐富、取材容易、倫理爭議小及免疫原性低等優點，使SHED運用于牙髓再生治療中具有廣闊前景。