骨保護素(OPG)基因多態性與種植體周圍組織疾病的相關性研究

姚舜 劉倩 鄧巍

種植體周圍組織疾病(peri-implant disease)是指發生在種植體周圍軟硬組織之間的一種病理狀態，包括僅累計種植體周圍軟組織的可逆的種植體周圍黏膜炎,以及可造成骨吸收的不可逆的種植體周圍炎，已成為現階段影響種植遠期成功最重要的因素之一[1]。時至今日，種植體周圍組織疾病其病因和發病機制尚未被完全揭示，除菌斑微生物、負載過重、口腔衛生習慣等[2-4]，近期研究表明，基因的多態性也是引起種植體周圍組織疾病的一大因素[5]。

骨保護素(osteoprotegerin，OPG)是于1997 年被發現的一種可溶性分泌型糖蛋白，相關研究已經證實其為骨代謝中的一個重要調控因子，可以通過抑制破骨細胞分化、活化、成熟等方式減緩骨吸收增加骨密度。目前，OPG與口腔疾病的相關性已被廣泛研究[6-8]，但尚未見到關于OPG-A163G位點多態性與種植體周圍組織疾病相關性的報道。本研究旨在探討OPG-A163G位點的基因多態性與種植體周圍組織疾病易感性的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年 10 月～2020 年3 月于中國醫科大學人民醫院口腔科就診的種植體周圍組織疾病患者與健康種植體患者各80 例，分為種植體周圍組織疾病組和健康種植體組，種植體周圍組織疾病組中又進一步細分為種植體周圍炎組(53例)和種植體周圍黏膜炎組(27 例)。病例納入標準:(1)患者已簽署知情同意書；(2)口內存在至少1 枚OSSTEM TSIII SA型種植體；(3)上部修復已滿至少1 年，均為單冠。病例排除標準：(1)存在影響骨代謝或愈合能力的全身疾病者；(2)近期接受過免疫抑制藥物治療或放射劑量超過60 Gy的頭頸部放療的患者；(3)近期使用過二磷酸鹽的患者；(4)3 個月內使用非甾體類抗炎藥、腎上腺皮質激素等的患者；(5)存在口腔內其他感染灶、頜骨囊腫等局部病變的患者；(6)存在不良口腔習慣的患者；(7)正在妊娠或哺乳的婦女；(8)設計不合理等醫源性因素所致者。

種植體周圍組織疾病的診斷遵循2017 年世界牙周和種植體周圍組織疾病分類研討會第四工作組共識報告所公布的種植體周圍組織疾病診斷標準[11]。健康種植體診斷標準：(1)無軟組織黏膜紅腫；(2)無探診出血;(3)無溢濃；(4)無探診深度增加；(5)骨改建后無牙槽脊頂水平的骨吸收。種植體周圍黏膜炎診斷標準：(1)骨改建后無牙槽脊頂水平的骨吸收；(2)存在溢濃或探診出血。種植體周圍炎診斷標準：(1)存在溢濃或探診出血；(2)與基線相比探診深度增加；(3)骨改建后存在牙槽脊頂水平的骨吸收。若缺少基線數據，則通過以下標準進行診斷：(1)探診深度≥6 mm；(2)溢濃或探診出血；(3)種植體周骨嵴頂距離種植體骨內最冠方處≥3 mm。

義齒修復完成的同時采集所有患者的臨床信息并以平行投照法獲取種植體的X線片以作基線資料。同時記錄所有患者基本病例資料。經檢驗，兩組間基本病例資料均無統計學差異(P>0.05)(表 1)。

表 1 兩組患者基本病例資料

1.2 主要儀器及試劑

PCR擴增儀、凝膠成像系統(Bio-Rad，美國)；恒溫震蕩水浴(WSY-065，無錫石儀)；低溫高速離心機(Thremo Scientific Heraeus Multifuge，德國)；水平電泳系統(北京六一儀器廠)；Taq Master Mix酶、DL2000 DNA Maker(大連寶生物工程有限公司)；引物、柱式口腔拭子基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；Loading Buffer(賽默飛世爾，美國)等。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA模板的制備 使用柱式口腔拭子基因組DNA抽提試劑盒在患者頰黏膜脫落的上皮細胞中提取目的DNA。

1.3.2 PCR擴增 引物的合成與設計：正向引物序列為5'-CTGGAGACATATAACTTGAACA-3',反向引物序列為5'-CCATCATCAAAAGGCCTATTGGT-3'。PCR反應體積：ddH2O 17 μL、Taq Master Mix酶25 μL、正向引物1.5 μL、反向引物1.5 μL、DNA模版5 μL，總體積50 μL。PCR反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重復32 個循環，最后72 ℃終末延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳：使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物是否為特異性擴增產物，并于凝膠成像系統下觀察并拍攝照片。

1.3.3 Sanger基因測序 將160 例合格的PCR產物進行Sanger基因測序，結果使用Chromas軟件分析。

1.4 統計學分析

研究對象進行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg，H-W)平衡定律檢驗，P>0.05則符合H-W平衡。應用SPSS 23.0分析實驗數據，采用χ2檢驗比較3 種基因型及等位基因分布頻率在不同組別中的差異;疾病相關風險用比值比(odds ratio,OR)及95%可信區間(confidence interval,CI)表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCR-Sanger測序結果

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，經PCR擴增后的產物長度為300 bp(圖 1)；將160 例合格的PCR產物進行Sanger測序后，峰圖中OPG-A163G位點共出現3 種基因型，即A/A、G/G和G/A(圖 2)。

圖 1 PCR擴增電泳圖

圖 2 Sanger基因測序圖

2.2 OPG-A163G基因型和等位基因的分布頻率

經檢驗，所選樣本符合H-W定律(P=0.07)，具有群體代表性。種植體周圍組織疾病組OPG-A163G基因型頻率分別為GG 12.50%、GA 37.50%、AA 50.00%，等位基因G頻率分布為31.25%，等位基因A頻率分布為68.75%；健康種植體組3 種基因型頻率分布分別為GG2.50%、GA22.50%、AA75.00%，等位基因G頻率分布為13.75%，等位基因A頻率分布為86.25%。兩組之間的比較存在統計學差異(基因型χ2=12.33，P=0.00;等位基因χ2=14.05，P=0.00)；其中，GG基因型的OR值為5.57(95%CI為1.18～26.31)，GA基因型的OR值為2.07(95%CI為1.03～4.13)，G等位基因的OR值為2.85(95%CI為1.63～4.99)，A等位基因的OR值為0.35(95%CI為0.20～0.61)(表 2)。種植體周圍炎組OPG-3102735 3 種基因型頻率分布分別為GG17.00%、GA39.62%、AA43.40%，等位基因G頻率分布為36.79%，等位基因A頻率分布為63.21%。經檢驗，種植體周圍炎組與健康種植體組之間的比較同樣存在統計學差異(基因型χ2=16.10，P=0.00;等位基因χ2=19.16，P=0.00)。其中，GG基因型的OR值為7.98(95%CI為1.65～38.58)，GA基因型的OR值為2.26(95%CI為1.06～4.84)；G等位基因的OR值為3.65(95%CI為2.01～6.64)，A等位基因的OR值為0.27(95%CI為0.15～0.50)(表 3)。進一步分析得知，種植體周圍黏膜炎組與健康種植體組之間不存在OPG-A163G基因多態性的差異(基因型χ2=1.85,P=0.37;等位基因χ2=1.36,P=0.24)(表 4)。

表 2 OPG-A163G基因多態性與種植體周圍組織疾病的關系 [n(%)]

表 3 OPG-A163G基因多態性與種植體周圍炎的關系 [n(%)]

表 4 OPG-A163G基因多態性與種植體周圍黏膜炎的關系 [n(%)]

3 討 論

近年來有研究提示，牙槽骨的骨改建可能與OPG-RANKL-RANK骨調節機制有關[10]。RANK為細胞核因子-κB受體活化因子，而RANKL為細胞核因子-κB受體活化因子配體，RANK與RANKL特異性結合后引起的級聯擴增反應可促使破骨細胞分化。而OPG可視為RANKL的誘騙受體，其通過與RANK競爭性地結合RANKL來阻斷破骨細胞分化的RANK/RANKL信號傳導途徑，從而抑制破骨細胞分化。此外，OPG還可直接減少破骨細胞的數量從而達到抑制其溶骨作用的目的[11]。鑒于OPG在骨代謝中所發揮的重要作用，其與種植體周圍組織疾病之間的關系也日益被重視。某些體外及動物實驗表明，OPG是調節慢性牙周炎患者牙槽骨吸收的重要因子[12]。Liu等[13]在實驗時發現OPG可以顯著增強種植體周圍的骨結合，并且可以有效改善骨小梁的顯微結構。Kapasa等[14]認為，增加種植體周圍OPG表達可減小種植手術的失敗率并有效控制種植術后并發癥的發生。

本研究選取的rs3102735位點位于OPG基因的啟動子區域。結果顯示，種植體周圍組織疾病組與健康種植體組研究對象OPG-A163G位點的基因型和等位基因分布存在統計學差異，表明種植體周圍組織疾病患者與健康種植體患者之間存在OPG-A163G位點多態性的差異，其中GG和GA基因型的OR值分別為5.57和2.07，表明GG和GA基因型的個體可能更易罹患種植體周圍組織疾病，G等位基因的OR值為2.85，表明G等位基因可能是種植體周圍組織疾病易感的危險因素之一，且攜帶至少一個G等位基因的個體患種植體周圍組織疾病的概率是未攜帶G等位基因個體患病率的2.85 倍，A等位基因的OR值為0.35，表明A等位基因可能是種植體周圍組織疾病的保護因素之一。在這一基礎上深化分析可得知，種植體周圍炎組與健康種植體組3種基因型及等位基因分布頻率的差異同樣有統計學意義(P<0.05)。其中GG基因型的OR值為7.98，GA基因型的OR值為2.26，表明基因型為GG和GA的個體可能更易患種植體周圍炎，G等位基因的OR值為3.65，表明G等位基因可能是種植體周圍炎易感的危險因素，且攜帶至少一個G等位基因的個體患種植體周圍炎的概率是未攜帶G等位基因個體的3.65 倍，A等位基因的OR值為0.27，表明A等位基因可能是種植體周圍炎的保護因素。種植體周圍黏膜炎組與健康種植體組患者之間不存在OPG-A163G基因多態性的差異(P=0.37)，表明OPG-3102735基因多態性與種植體周圍黏膜炎無明顯相關性，或僅通過與其他基因的協同作用而致病。在此領域，Zhou等[15]也進行了相關的探索，其在研究OPG-T950C和OPG-G1181C位點基因多態性與種植體周圍炎易感性之間的關系時發現，OPG-1181G/C位點的多態性可能與種植體周圍炎的發病風險相關，且CC基因型攜帶者比GG基因型攜帶者更易患種植體周圍炎(P=0.04，OR=2.18)。此外，攜帶C等位基因的患者患種植體周圍炎的風險是未攜帶C等位基因患者的1.47 倍(P=0.04，OR=1.47，95%CI=1.01～2.13)，而OPG-950T/C位點的病例組與對照組之間基因型及等位基因的分布頻率無顯著差異(P>0.05)，同時在研究中共發現了G-T、C-C、G-C和C-T 4 種單體型，其中G-C單體型可能與種植體周圍炎易感性的增加有關。這與Kadkhodazadeh等[16]的研究結果相一致。

本研究結果提示，OPG-A163G基因位點的多態性很可能是種植體周圍組織疾病發生的一個重要危險因素，結合高娟娟等[17]的研究，為進一步揭示種植體周圍組織疾病的發病機制及早期預防和治療等提供了一定的理論參考依據?？紤]到本實驗的研究對象主要局限在中國東北地區人群中，故選擇性效應難以完全避免，且存在樣本量較小等問題，這些都可能對研究結果產生一定程度上的影響，故后續尚需進行大樣本、多種族、多基因的研究。此外，OPG基因啟動子和內含子中的其他多態性位點也應被更多的納入分析之中，以分析其不同位點之間的連鎖效應。