SOX5在口腔鱗癌CAL27細胞增殖、遷移和侵襲中的作用研究

王亞娥 孫李春 陳鐳雨 曾妍 鄭軍

832000, 石河子大學醫學院第一附屬醫院口腔科，石河子大學醫學院新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室

性別決定區域Y盒蛋白5(SOX5)屬SOXD亞族的成員，研究發現SOX5的異常表達參與多種腫瘤的發生、發展，包括垂體瘤、膠質母細胞瘤、淋巴瘤、肝癌等[1]，且與腫瘤的生物學行為密切相關，對于腫瘤而言，腫瘤細胞的生物學行為對于腫瘤的發展發揮著不可或缺的作用。本研究通過干擾SOX5探討其對CAL27細胞增殖、遷移和侵襲的作用，為口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的診治及預后提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及轉染

常規培養CAL27細胞，轉染時提前一天將細胞接種至六孔板，按Lipofectamine 2000(Invitrogen,美國)說明書進行轉染，對照組轉染Si-NC,實驗組轉染Si-SOX5。轉染后收集細胞，進行后續研究。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)

使用Trizol(Invitrogen,美國)提取細胞中總RNA。逆轉錄合成cDNA，QuantiNava SYBR Green RT-PCR Kit試劑盒(QIAGEN,德國)進行qRT-PCR。引物序列為：SOX5正向5' -AACAAGCACAGATCCCCATTG-3' 和反向5' -ACACCGTAAGTGCTCTGGATA-3'；GAPDH正向5' - GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3' 和反向5' - ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3' 。

1.3 免疫印跡實驗(Western blot)

RIPA裂解緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)提取細胞中總蛋白，電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上。按所需分子量裁膜，封閉后分別與SOX5(博士德生物工程有限公司)和GAPDH抗體稀釋液4 ℃過夜孵育12 h左右，加入稀釋后酶標羊抗兔IgG和酶標羊抗小鼠IgG(DAKO，美國)常溫低速搖床孵育2 h。進行發光檢測。

1.4 平板克隆實驗

調整細胞密度加入6 孔板(5 000 個細胞/孔)，每組重復3 孔，繼續培養10～14 d，定期換液，出現肉眼可見的克隆時停止培養，冰甲醇固定15 min，結晶紫染色30 min，沖洗晾干后拍照，細胞計數軟件計數克隆細胞數，以數目大于50 個的細胞克隆為有效克隆，計算克隆形成率(%)=細胞平均克隆數/接種細胞個數(5 000)×100%。

1.5 劃痕實驗

待細胞融合度接近100%時進行劃痕處理，0、24、48 h于40 倍鏡下觀察劃痕愈合情況(白光BF)，拍照保存。Image J計算劃痕上的遷移面積，計算得到劃痕愈合率，公式:劃痕愈合率(%)=(初始劃痕面積-24 h及48 h遷移后劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲

DMEM培養基調節細胞濃度到5×105個/mL，遷移時上室加入200 μl(1×105個)細胞懸液，侵襲時向已鋪有稀釋Matrigel膠(BD，美國)的上室加入200 μl(3×105個)細胞懸液，下室分別加入適量含有10%FBS及15%FBS的DMEM培養基，分別培養24 h、48 h，冰甲醇固定，結晶紫染色，用棉簽擦去上室細胞、基質膠等，洗凈晾干后，倒置于顯微鏡下隨機選取5 個視野對染色細胞進行細胞計數。

1.7 統計學處理

所有資料采用SPSS 23.0進行統計分析，對計量資料進行組間比較，采用獨立樣本t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SiRNA干擾CAL27細胞中SOX5的表達

Western blot及qRT-PCR顯示，實驗組CAL27細胞中SOX5表達減低，結果顯示干擾有效(圖 1)。

圖 1 CAL27細胞中蛋白及mRNA水平的表達

2.2 干擾SOX5表達對CAL27細胞增殖能力的影響

平板克隆結果示，實驗組及對照組平均克隆形成率分別為1.37%和3.29%，實驗組生長增殖能力較對照組降低明顯(P<0.01)(圖 2)。

圖 2 干擾SOX5表達對CAL27細胞增殖能力的影響

2.3 干擾SOX5表達對CAL27細胞劃痕愈合能力的影響

劃痕結果顯示，實驗組劃痕愈合率較對照組下降(P<0.05)，且48 h時更為明顯(P<0.01)(圖 3)。

圖 3 劃痕實驗檢測下調SOX5表達對CAL27細胞劃痕愈合能力的影響

2.4 干擾SOX5表達對CAL27細胞遷移及侵襲能力的影響

Transwell法遷移結果顯示，實驗組遷移能力較對照組下降顯著(P<0.01)，侵襲實驗結果顯示，實驗組侵襲能力較對照組顯著下降(P<0.01)(圖 4)。

圖 4 干擾SOX5表達對CAL27細胞遷移和侵襲能力的影響 (×100)

3 討 論

OSCC作為頜面部常見腫瘤類型之一，近年來的患病率呈現逐年升高態勢，其惡性程度高，且腫瘤容易出現局部侵襲和淋巴結轉移，使得患者存活率較低，影響生活質量[2]。對于早期OSCC的治療，主要的治療策略仍是手術切除，術后輔以放化療。然而OSCC的總體治療結果仍然不佳。近年來，越來越多學者將研究熱點集中于腫瘤的分子靶向治療，以期探索新的靶點能夠有助于OSCC的診斷及治療。

性別決定區域Y盒蛋白5(SOX5)具有HMG (high-mobility group) 結構域,也具有coiled-coil結構域,因而SOX5可以直接結合DNA或者蛋白，調節基因使其表達[3]。SOX5作為一種轉錄因子已被證明與各種癌癥的致癌功能有關，其在腫瘤發展及轉移中的作用并不一致，已有研究表明，SOX5既可以抑制腫瘤也可以促進腫瘤的進展。在肝癌中Wang等[4]研究發現，在SOX5低表達的細胞中過表達SOX5可以增加細胞的遷移和侵襲能力,而在SOX5高表達的細胞敲除SOX5可以抑制細胞的侵襲力。在肺腺癌中SOX5高表達并且能促進肺腺癌細胞的增殖和轉移能力[5]。在骨肉瘤及胃癌中SOX5能促進骨肉瘤細胞及胃癌細胞的遷移和侵襲能力[6-7]。在乳腺癌中SOX5可以調控Twist促進乳腺癌轉移[8]。在侵襲性垂體瘤中,垂體瘤細胞系GH3在敲除SOX5后,細胞的增殖、侵襲及遷移能力均受到抑制[9]。與以往有關SOX5在其他腫瘤中的研究結果一致，平板克隆、劃痕及Transwell遷移實驗結果表明，下調SOX5表達后，細胞生長增殖能力、劃痕愈合能力和遷移能力明顯減弱，在之后的實驗中，本研究利用Transwell法檢測細胞侵襲能力，轉染Si-SOX5的細胞的侵襲能力亦明顯減弱。

綜上所述，以上結果提示，干擾SOX5可抑制OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲。這一研究結果將有望為OSCC的治療，提供新的生物治療靶向，但其具體機制有待進一步研究。