P38 MAPK通路抑制劑對UC-MSC功能的影響

方明霞 董藝超 成子安 范雨萱 陳昱圻 高建恩 郭昌龍 馬 旭*

1.北京協和醫學院研究生院(100730)；2.國家衛生健康委科學技術研究所

間充質干細胞(MSC)具有組織修復和免疫調控的作用：在炎癥環境中能夠有效的抑制T、B淋巴細胞的增殖，增加Treg細胞的含量；在體內或體外特定的誘導條件下，能夠分化成骨、軟骨、脂肪等多種細胞，目前被廣泛的應用于組織損傷修復、自身免疫性疾病的治療[1]。P38 MAPK信號通路是細胞內信息傳遞的主要信號通路之一，可調節細胞生長、分化、炎癥、壓力刺激、凋亡等多種病理生理過程，是促炎性細胞因子合成的關鍵調節途徑[2]。本研究利用P38 MAPK通路抑制劑SB202190抑制臍帶間充質干細胞(UC-MSC)的P38 MAPK通路，觀察該通路抑制對UC-MSC形態、表型以及分化能力的影響，進一步評價P38 MAPK通路抑制的UC-MSC促進糖尿病大鼠背部皮損修復的能力。

1 材料和方法

1.1 材料

第3代臍帶間充質干細胞購自中盛溯源公司；SPF級7周齡ZDF雌性大鼠購自北京維通利華公司；DMEM-F12培養液、胎牛血清、雙抗、PBS、0.25% Trypsin購自美國Gibco公司，人臍帶間充質干細胞成脂誘導分化試劑盒購自Cyagen公司，小分子化合物SB202190購自MCE公司，流式檢測所用抗體CD14、CD19、CD31、CD73、CD105、CD44、CD90、CD34、CD45、CD146、HLA-DR購自Biolegend公司；6孔細胞培養板購自康寧公司，血糖儀、血糖試紙(1835960)購自穩捷公司；離心機購自湘儀公司，流式細胞儀采用BD Biosciences FACS Calibur。

1.2 細胞實驗

1.2.1UC-MSC的復蘇培養與鑒定取第3代UC-MSC復蘇后，接種于含10%FBS+1%Anti-anti+DMEM /F12的培養瓶中于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。

1.2.2UC-MSC的小分子化合物處理UC-MSC在完全培養基中培養至第5代，0.25% Trypsin消化后接種于完全培養基，培養至融合度達80%時，實驗組換用含8μM濃度小分子化合物SB202190的誘導培養基培養，誘導處理48h后，收集兩組細胞，流式檢測細胞表面CD14、CD19、CD31、CD73、CD105、CD44、CD90、CD34、CD45、CD146、HLA-DR的表達，同時進行成脂分化誘導培養。

1.2.3多組學測序收集上述兩組細胞樣本送至北京華大蛋白質研發中心有限公司進行轉錄組測序、小RNA測序。KEGG、GO富集分析各組學檢測結果，篩選實驗組與對照組細胞之間的差異表達基因。

1.3 動物實驗

1.3.1構建糖尿病大鼠模型從北京維通利華公司購入7周齡ZDF雌性大鼠，常規飼料喂養1周后換用高脂飼料(上海雍利)喂養，室內保持12h晝夜節律，溫度(25±2)℃，自由攝食、飲水，每周檢測大鼠血糖值、記錄體重變化，至空腹血糖值穩定維持在11.1 mmol/L以上，以成功構建糖尿病大鼠模型。

1.3.2創傷修復對建模成功的糖尿病大鼠進行隨機分組：PBS干預組、UC-MSC干預組、P38 MAPK通路抑制的UC-MSC干預組，于各組大鼠背部開創1.5cm×1.5cm的正方形傷口，分別于傷口四邊皮下定點注射200μl PBS、200μl PBS重懸的1×106UC-MSCs、200μl PBS重懸的1×106P38 MAPK通路抑制的UC-MSCs，隔天測量大鼠背部傷口面積，繪制傷口愈合曲線。

1.3.3免疫組化糖尿病大鼠背部傷口愈合率≥90%時取背部愈合組織，制備3μm厚的石蠟切片，分別用苯胺藍染液、天狼星紅染液對切片進行馬松染色和天狼星紅染色，觀察各組大鼠背部愈合組織的膠原沉積情況。

2 結果

2.1 臍帶間充質干細胞干性鑒定

顯微鏡下UC-MSC和P38 MAPK抑制-UC-MSC在生長過程中均呈現典型的MSC形態，即長梭形(圖1)(1077頁)，細胞倍增時間為36h，證明P38 MAPK抑制劑處理不會造成UC-MSC細胞形態以及擴增周期的改變；成脂誘導分化實驗中UC-MSC以及P38 MAPK抑制-UC-MSC在誘導分化的第21天經油紅O染色于鏡下均可觀察到大量透亮且圓的脂滴(圖2)(1077頁)；流式細胞術檢測UC-MSC和P38 MAPK抑制-UC-MSC表面標志物表達情況，陽性標志物占比均>95%;陰性標志物占比均<2%(表1)，符合國際細胞療法協會(ISCT)定義的MSC三陽五陰的標準，即≥95%的細胞表達CD105、CD73、CD90，且表達CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR的細胞≤2%。

表1 兩組細胞表面標志物檢測結果 (%)

2.2 多組學測序

通過KEGG功能注釋、GO富集分析P38 MAPK抑制-UC-MSC與UC-MSC的轉錄組測序、小RNA測序結果，發現P38 MAPK通路抑制的UC-MSC與未處理的UC-MSC存在大量差異表達的基因(圖3，4)(1077、1078頁)。隨著DUSP8、FST、ITGB8等基因表達的增強，與之對應的細胞信號通路TGF-β signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway等也發生上調。另外，生物信息學聯合分析測序結果發現P38 MAPK通路抑制的UC-MSC中PAI-1的表達增強(圖5)(1078頁)，提示對應的下游與表皮損傷愈合有關的VEGF signaling pathway發生上調。

2.3 動物實驗

于糖尿病大鼠背部損傷部位進行皮下干預，隔天測量大鼠背部傷口面積，在第3天經計算得到到P38 MAPK抑制-UC-MSC干預組糖尿病大鼠背部損傷皮膚愈合率29.9%，高于UC-MSC干預組的15.9%以及PBS對照組2.4%(圖6)(1079頁)；至第15天可肉眼觀察到P38 MAPK抑制-UC-MSC干預組糖尿病大鼠背部皮損的愈合較另兩組好，經測量皮損愈合率均已達90%，傷口愈合組織馬松染色及天狼星紅染色可觀察到P38 MAPK抑制-UC-MSC干預組傷口部位膠原形成情況較UC-MSC干預組以及PBS對照組好(圖6)(1079頁)，綜合各組大鼠背部傷口愈合情況、免疫組化結果以及愈合曲線(圖7)(1079頁)可知P38 MAPK通路抑制的UC-MSC促進組織修復的效果得到增強。

3 討論

UC-MSC的組織修復和免疫調節的功能對于多種疾病的治療及其研究都具有實際意義，同時UC-MSC易獲取的特點使其成為再生領域的首要候選細胞，已有研究顯示MSC可直接或間接促進表皮傷口愈合，涉及到的機制：①直接分化和替換丟失的組織成分；②將宿主細胞(如成纖維細胞，角質形成細胞，巨噬細胞和祖細胞)募集到受傷部位調節局部修復反應；③通過減弱免疫效應細胞的增殖并改變其細胞因子譜的產生緩解過度炎癥反應；④釋放免疫抑制和抗炎因子，如轉化生長因子TGF-1，IL-4，吲哚胺2，3-二加氧酶；⑤通過直接的細胞間接觸，分泌可溶性因子VEGF，FGF和IL-6促進血管形成，以及釋放外泌體促進慢性傷口愈合[3]。

P38 MAPK通過激活涉及各種細胞功能(如細胞凋亡，細胞生長和分化)的轉錄因子而發揮其生物學作用。P38 MAPK通路激活后，存在于細胞質或細胞核中的轉錄因子就會被磷酸化和激活，目標基因表達，從而導致生物學反應的發生。這些轉錄因子主要包括ATF-1，ATF-2，GADD153，肌細胞增強因子(MEF)2C，CREB，C / EBP同源蛋白(CHOP)，p53和NF-kB等[4-8]。p38 MAPK途徑可以有效調節人全血、肺泡巨噬細胞、單核細胞、滑膜細胞和內皮細胞中促炎性細胞因子(如TNF-α，IL-1，IL-2，IL-6，IL-7和IL-8)的表達和活性[9]，另外，p38 MAPK途徑在免疫系統的細胞增殖和分化中也起到重要的調節作用，參與GM-CSF，CSF，EPO和CD40誘導的細胞增殖和分化[10-11]。

本研究發現抑制UC-MSC的P38 MAPK信號通路能夠增強UC-MSC中VEGF信號通路上游基因PAI-1的表達，提示VEGF信號通路的上調。VEGF信號通路是組織修復的重要通路之一，其過表達能夠有效的促進傷口愈合，本研究中動物實驗的結果提示VEGF信號通路上調可作為P38 MAPK通路抑制的UC-MSC促進大鼠背部皮損愈合的推理原因之一，但是關于P38 MAPK通路抑制的UC-MSC促進傷口愈合的確切機制還需進一步研究。