不同年齡段女性膠質母細胞瘤差異蛋白組學分析

蘭春燕 李海南 王 磊 戴利軍 邵佳芬 高華方,* 馬 旭

1.國家衛生健康委科學技術研究所(北京，100081)；2.北京協和醫學院研究生院；3. 廣東三九腦科醫院

膠質瘤是最常見的原發性顱內中樞神經系統腫瘤[1]，約占顱內惡性腫瘤的80%，其中膠質母細胞瘤(GBM)是惡性程度最高的膠質瘤，患者病情發展隱匿，即使經過最積極的治療，中位生存期僅為15個月[2]。研究表明，不同性別的患者驅動GBM發展的過程及對治療反應方面存在差異，且年齡也是GBM預后的重要評判指標[3]。Ohgaki等[4]對751例不同年齡組GBM患者的研究發現，年齡<50歲GBM患者的生存期為8.8個月；而年齡≥50歲組GBM患者的生存期為4.1個月，即年齡≥50歲的晚發GBM患者的預后比中青年患者差[5]。多項研究致力于從基因層面探尋膠質瘤的新的治療靶點[6-7]，但由于蛋白是細胞生物學功能的直接執行者，因此蛋白組學是分析GBM相關疾病的強有力的工具[8]。本研究采用蛋白組學技術對不同年齡段女性GBM患者的差異表達蛋白進行分析，尋找與年齡相關的差異表達蛋白，并通過生物信息學分析為不同年齡段GBM女性患者的靶向診療提供思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入廣東省三九腦科醫院2018-2020年收治的18例GBM女性患者為研究對象，患者中位年齡49歲(20～71歲)。其中年齡<50歲10例；≥50歲8例。本研究獲得廣東三九腦科醫院倫理委員會的批準，患者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。本研究符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 樣本制備與數據采集

所有組織樣本均通過手術或活檢的方式取自GBM患者腦部腫瘤病變區域。18例GBM活檢組織均從-80℃冰箱取出，進行樣本預處理。蛋白提取后，采用Bradford蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度的測定，并通過凝膠電泳實驗對條帶清晰度等的判斷進行蛋白質檢。取120μg蛋白樣品經胰蛋白酶酶解，采用18C除鹽柱進行除鹽后，進入質譜儀內上機檢測。采用數據依賴采集(DDA)的方式進行真實譜圖庫的構建。使用配有Nanospray FlexTM(ESI)離子源的Q ExactiveTMHF-X 質譜儀進行數據的采集，設定離子噴霧電壓為2.5kV，離子傳輸管溫度為320℃，質譜全掃描范圍為m/z 350-1500，使用高能碰撞解離(HCD)方法碎裂進行二級質譜檢測。下機后的文件直接導入到Proteome Discoverer 2.2軟件進行數據庫的檢索及蛋白的定量分析。

1.3 統計學分析

使用Excel軟件篩選在所有GBM樣本中均表達的蛋白。在R(版本3.6.1)語言環境下，R Studio利用limma軟件包進行兩組不同年齡段GBM組織內差異蛋白組學數據的處理，應用P<0.05及差異倍數(FC)>2的指標進行差異蛋白的篩選。使用ggplot2軟件包進行兩組間差異蛋白的可視化，將Log2(FC)作為橫軸，-Log10(P)為縱軸進行火山圖的繪制。使用微生信在線網站進行成比例韋恩圖的繪制。采用Kobas軟件對蛋白進行功能注釋，使用metascape軟件進行差異蛋白的基因本體(GO)細胞組成(CC)的富集分析，并進行京都基因和基因組百科全書(KEGG)功能富集分析。采用STRING軟件進行99種差異顯著蛋白的相互作用網絡分析，并將分析結果導入Cytoscape v.3.7.2軟件進行蛋白互作網絡結果的可視化。

2 結果

2.1 差異蛋白組學分析

使用uniprot數據庫進行蛋白的注釋，可信度在99%以上的譜肽(PSMs)為可信PSMs，將至少含有1個特異性肽段的蛋白定義為可信蛋白，本研究只保留可信的譜肽和蛋白，并進行錯誤發現率(FDR)驗證，去除FDR>1%的肽段和蛋白。通過上述過濾標準，在18例女性GBM患者中共鑒定到4617種蛋白，其中3530種蛋白在所有GBM組織中均表達。僅在年齡≥50歲的女性GBM患者中表達的蛋白數目為813種，而僅在年齡<50歲的女性GBM患者中表達的蛋白數目為274種。篩選得到≥50歲組GBM中上調表達蛋白共計71種，下調蛋白共計28種(圖1)(1079頁)。將數據歸一化后進行聚類熱圖的繪制，能夠可視化差異表達蛋白在每例患者病變組織內的上下調情況(圖2)(1080頁)。

2.2 差異表達蛋白功能富集分析

通過對差異蛋白進行GO細胞定位富集分析，發現差異蛋白主要定位在細胞外囊泡及肌動蛋白骨架及脂膜筏(圖3A)(1080頁)。通過KEGG信號通路富集分析發現，差異蛋白主要參與的信號通路是細胞凋亡和肌動蛋白細胞骨架的調節(圖3B)(1080頁)，且參與上述信號通路的差異蛋白在高齡女性GBM患者中表達量均明顯上調(P<0.05，FC>2)。

2.3 差異蛋白相互作用網絡分析

對99種差異蛋白進行相互作用網絡分析。以連接度大小作為關鍵蛋白的評價指標，本研究結合文獻調研情況及數據分析結果，篩選了3個連接度最大的蛋白作為關鍵蛋白(圖4)(1080頁)。3個關鍵蛋白及其對應的編碼基因分別是α1-酸性糖蛋白(ORM1)、膜聯蛋白(ANXA2)、α1-酸性糖蛋白2(ORM2)。

3 討論

GBM作為惡性程度最高的腦部腫瘤，主要見于成年人。人類對GBM疾病的病情進展及結局在性別和年齡上的差異已經成為共識，但目前尚無針對不同年齡段抑或是不同性別GBM患者的靶向針對性治療，從分子角度探尋蛋白靶點對GBM患者的精準靶向治療尤為必要。

蛋白組學技術可以進行高通量的蛋白篩選和發現，通過差異蛋白組學研究，有利于發現與疾病發生發展相關的重要蛋白分子，進而解析疾病發病機制，促進對疾病的精準診療。本研究采用DIA蛋白組學技術，數據采集的時候將整個掃描窗口劃分為若干個窗口，再對每個窗口的離子進行二次碎裂，可以采集所有的離子信息[9]。相比于傳統的DDA技術，該技術對蛋白的覆蓋度更高，在18例GBM女性患者病變組織的DIA蛋白組學研究共鑒定了4617種蛋白。因此將<50歲組和≥50歲組女性患者腫瘤組織的差異表達蛋白進行功能富集分析和相互作用網絡分析，可能會揭示女性GBM患者不同的預后原因。

α1-酸性糖蛋白是一種急性期反應蛋白，主要由肝臟分泌的蛋白質，有證據表明該蛋白也可在淋巴細胞和腫瘤細胞中合成[10-11]。已經有大量的研究報道該蛋白在患者體內的含量與多種腫瘤如肝癌、胰腺導管腺癌等疾病的預后呈負相關[12-13]。相關研究表明，相比存活期較長的GBM患者，α1-AG在預后差、生存期短的患者體內的含量更高，這可能是與α1-AG含量增加所導致的免疫功能受損密切相關[14]。這將為GBM的惡性進展提供機制的見解。

膜聯蛋白是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，是一種高豐度蛋白，在各種腫瘤細胞中異常高表達。研究表明該蛋白與炎癥、腫瘤密切相關[15-16]。相關研究報道膜聯蛋白與膠質瘤的增殖相關[17]，是調節血管生成和惡性神經膠質瘤侵襲的因素，并且膠質瘤級別與該蛋白陽性率呈正相關[18]。該蛋白可能通過STAT3-cyclin D1信號通路調控膠質瘤細胞的增殖[19]。由此推斷，該蛋白的高表達可能作為高齡GBM患者預后差的潛在蛋白標記。

綜上所述，本研究對兩個年齡段女性GBM的差異蛋白組學進行分析，不僅發現了差異蛋白的細胞定位及可能參與的信號通路，為了解高齡GBM患者預后，更為不理想的發病機制提供一定的思路；而且還挖掘了3個調節GBM惡性增殖的潛在蛋白靶點，這將為不同年齡階段GBM患者的精準治療有所幫助。不過這一初級結論還需后續擴大樣本量進行驗證的同時，納入分子生物學實驗，進一步探究本文挖掘的3個關鍵蛋白對GBM惡性增殖的調控作用以及潛在的分子機制。