長鏈非編碼RNA LINC01006在前列腺癌組織中的表達水平及臨床意義

楊曉峰，王倩倩，田濤

前列腺癌(PCa)是全世界公認的老年男性惡性腫瘤，發病率和死亡率較高，被列為第三大常見的致命癌癥之一[1-3]。PCa早期缺乏特異性生物標志物導致診斷較難。因此，深入研究PCa中潛在的分子機制對PCa診治具有重要意義。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是一組長度大于200 nt的轉錄物，沒有蛋白質編碼動能[4]。既往研究顯示，lncRNAs為多種癌細胞凋亡機制中的重要調節因子[5-7]。LINC01006在PCa發病中的作用機制仍不清楚。lncRNAs作為一種競爭性內源性RNA(ceRNA)參與腫瘤的發生發展，也可作為miRNAs調節mRNAs的海綿吸附作用[8-10]。本文研究LINC01006在PCa中的ceRNA調控機制，并對其作用機理進行探討。

1 材料與方法

1.1 資料 選取2016年1月—2020年6月本院確診并進行前列腺癌根治術治療的患者34例為研究對象，年齡44～78( 64.75±8.04) 歲。納 入 標 準:(1)經病理確診為前列腺癌;(2)臨床及隨訪資料完整;(3)行手術治療;(4)本人及家屬知情并簽署知情同意書。排除標準:(1)非新發前列腺癌患者;(2)合并糖尿病、高血壓、冠心病等疾病的患者;(3)其他惡性腫瘤患者。本研究經醫院倫理委員會批準通過。

1.2 材料 人正常細胞系(RWPE-1)和DU145、PC3、LNCAP及VCaP 4種人PCa細胞系均來自美國典型菌種保藏中心ATCC (Manassas, VA)。將所有細胞置于含10% FBS的DMEM培養基中，在37 ℃、5% CO2環境中培養。LINC01006的shRNA及相應的對照shRNA質粒均由Genechem公司(中國 上海)合成。miR-34a-5p模擬物/抑制劑和NC模擬物/抑制劑購自RiboBio公司(中國 上海)。TRIzol試劑(Invitrogen, USA)分離總RNA，使用反轉錄試劑盒PrimeScript RT master mix (Takara, Tokyo, Japan)合成cDNA。BeyoClick EdU-594細胞增殖檢測試劑盒來自Beyotime公司(中國 上海)。TUNEL試劑使用Merck KGaA(Darmstadt, Germany)?；|凝膠使用BD Biosciences(San Diego, CA, USA)。BALB/c裸鼠(5～6周齡)來自SLRC實驗動物(中國 上海)。

1.3 實驗方法

1.3.1 質粒的構建和轉染 將pcDNA3.1載體(Invitrogen)用LINC01006亞克隆過表達，空pcDNA3.1載體作為陰性對照。所有細胞轉染均使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)。

1.3.2 總RNA提取及實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 使用TRIzol試劑分離總RNA，使用反轉錄試劑盒合成cDNA。應用SYBR Green PCR試劑盒進行qPCR測定分子表達水平。分別以U6、GAPDH作為內參對照，再用2-△△Ct法計算結果。

1.3.3 集落形成實驗 細胞以每孔500個細胞的密度接種于6孔板中孵育2周。4% PFA固定30 min后，用0.5%結晶紫溶液染色5 min，最后手工記錄可見集落。

1.3.4 EdU實驗 使用細胞增殖檢測試劑盒進行EdU增殖測定。將轉染的細胞以1×104細胞/孔在96孔板中培養。 使用EdU和DAPI溶液進行雙重染色后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞。

1.3.5 TUNEL檢測 將轉染的DU145和LNCAP細胞用4%的PFA處理，然后加入TUNEL試劑，DAPI染料染色后，使用光學顯微鏡對標記的樣品進行分析。

1.3.6 流式細胞儀 雙染細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。用結合緩沖液雙重染色15 min后，用流式細胞儀(FACScan，BD Biosciences)測定細胞樣品。

1.3.7 Transwell檢測 取2×104細胞加入transwell板的上腔室。然后在底腔中加入100%完全的培養基。將基質凝膠加入細胞中進行侵襲實驗。24 h后，細胞用結晶紫染色計數。

1.3.8 動物實驗 取BALB/c裸鼠(5～6周齡)，將sh-NC和sh-LINC01006#1轉染的DU145細胞懸浮在PBS中，然后注射到小鼠體內。每5天測量腫瘤體積。1個月后，對小鼠實施安樂死。將小鼠體內腫瘤切除并稱重。將轉染sh-NC和sh-LINC01006#1的DU145細胞注射到裸鼠尾靜脈進行腫瘤轉移實驗。50 d后對小鼠實施安樂死。取肺后用濕甲醛溶液固定，進行蘇木精-伊紅染色。最后在顯微鏡下觀察肺轉移灶。所有動物實驗均經山東省濟寧醫學院附屬棗莊市立醫院倫理委員會批準。

2 結果

2.1 LINC01006對PCa細胞增殖、凋亡和侵襲功能的影響 GEPIA數據庫分析LINC01006表達水平(http://gepia.cancer-pku.cn/)，LINC01006在PCa組織和非癌組織中表達差異具有統計學意義(P<0.05)；以正常人前列腺上皮細胞系(RWPE-1)為對照，LINC01006在PCa細胞系(DU145、PC3、LNCAP和VCaP)中明顯表達上調(圖1)。敲除了PCa細胞中的LINC01006，通過細胞克隆增殖和EdU分析顯示，LINC01006沉默后細胞增殖顯著下降，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。TUNEL實驗分析顯示，LINC01006下調促進細胞凋亡(圖3)。transwell分析結果顯示，LINC01006缺陷后DU145和LNCAP細胞的遷移和侵襲能力顯著降低(圖4)。即LINC01006對PCa細胞增殖、遷移和侵襲有明顯的促進作用。

1A GEPIA數據庫分析LINC01006的表達水平 1B PCa細胞系中LINC01006表達水平(與RWPE-1比較，*P<0.05)圖1 GEPIA數據及PCa細胞系中LINC01006表達

3A TUNEL實驗顯示細胞凋亡視野 3B 轉染細胞凋亡率(sh-NC與sh-LINC01006#1,sh-NC與sh-LINC01006#2比較，*P<0.05)圖3 TUNEL實驗分析結果

4A 下調LINC01006,ytranswell分析遷移能力結果 4B 下調LINC01006,ytranswell分析侵襲能力結果(sh-NC與sh-LINC01006#1,sh-NC與sh-LINC01006#2比較，*P<0.05)圖4 transwell分析遷移和侵襲結果

2.2 LINC01006的海綿吸附作用 以starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)在CLIP數據>=1，Degradome數據>=0，泛癌>=6的條件下，篩選出3個miRNA(miR-148b-3p、miR-34a-5p和miR-6783-3p)，因miR-34a-5p是唯一顯示下調表達的miRNA，假設LIN01006是miR-34a-5p的海綿，圖5顯示了預測結合位點。將miR-34a-5p模擬物轉染到PCa細胞中，顯示miR-34a-5p過度表達抑制了細胞增殖(圖6)；流式細胞儀檢測發現細胞凋亡率提高(圖7)；transwell分析顯示miR-34a-5p模擬物降低細胞的遷移和侵襲能力(圖8)。即miR-34a-5p為LINC01006海綿吸附作用位點，能減緩PCa的進展。

圖5 star Base預測LIN01006與miR-34a-5p結合位點

6A 模擬物轉染細胞，細胞克隆增殖視野 6B 細胞增殖結果比較(2組比較，*P<0.05)圖6 細胞克隆增殖結果

2.3 LINC01006基因對實驗動物體內腫瘤生長和轉移的影響 將轉染sh-NC和sh-linc1006#1的DU145細胞注入6周齡裸鼠體內。結果顯示，與對照組相比，sh-LINC01006#1敲除組的腫瘤體積變小(圖9)。LINC01006被敲除后，腫瘤生長速度變慢(圖10)。建立肺轉移模型結果顯示，sh-LINC01006#1組的轉移結節數量明顯減少(圖11)，LINC01006沉默后體內轉移受到抑制。即通過敲除LINC01006，可以抑制動物體內PCa腫瘤的生長和轉移。

7A miR-36a-5p上調后DU145細胞株凋亡率 7B miR-36a-5p上調后LNCAP細胞株凋亡率圖7 流式細胞檢測

8A miR-36a-5p上調后，transwell檢測細胞遷移能力 8B miR-36a-5p上調后，transwell分析侵襲能力(NC與miR-34a-5組比較，*P<0.05)圖8 transwell分析遷移和侵襲結果

圖9 2組實驗動物腫瘤比較

圖10 2組實驗動物腫瘤生長測量圖。(組間比較，*P<0.05)

2.4 LINC01006表達與術后病理和患者預后的關聯性 前列腺癌患者癌組織中LINC01006表達量水平為5.82±0.14，以≥5.50為LINC01006高表達，<5.50為LINC01006低表達，分析前列腺癌患者臨床參數與LINC01006表達的關聯性。如表1所示，前列腺癌組織中LINC01006的表達水平與前列腺癌患者的年齡和腫瘤大小無關(P>0.05) ；與前列腺癌患者的術前PSA值、病理Gleason 評分及遠處或淋巴結轉移有關(P<0.05)。

11A 轉染sh-NC組肺細胞轉移瘤(×200) 11B 轉染sh-linc1006#1組肺細胞轉移瘤(×200)(每視野計數比較，P<0.05)圖11 HE染色，肺轉移模型比較

表1 LINC01006表達與臨床資料的關聯性

續表1

3 討論

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，近幾年發病更有年輕化趨勢，危害男性健康。隨著疾病進展會引發排尿障礙、疼痛、腎功能衰竭及尿潴留等癥狀,甚至轉移至骨骼、淋巴結及全身多器官。探索新的特異性分子生物標志物及與前列腺癌增殖、擴散及轉移機制對前列腺癌診療有重要意義。lncRNAs異常表達影響癌癥的發病進展，主要通過影響細胞的增殖、遷移和侵襲能力[11-12]。如，PCGEM1/miR-433-3p/FGF2信號通路異常導致腎癌細胞的惡性表型[13]，PVT1通過隔離miR-526b調節EZH2在非小細胞肺癌中作為腫瘤啟動子發揮作用[14]，OIP5-AS1上調促進胃癌發病進展[15]。LINC01006在前列腺癌中的作用及機制的研究少有報道。本研究發現LINC01006沉默后細胞增殖顯著下降，細胞凋亡增加，動物實驗進一步證實敲除LINC01006基因抑制了前列腺癌細胞在體內擴散及轉移。而前列腺癌細胞中LINC01006表達上調促進前列腺癌的發病進展，以上結果表明LINC01006在前列腺癌發病中的作用。

研究表明，ceRNA網絡通路是lncRNAs潛在的致病機制，如lncRNA XIST通過介導的ceRNA調控信號通路促進腫瘤進展[16]。張榮魁等[17]研究發現BCAR4通過作為miR-370-3p海綿激活Wnt信號通路加重膀胱癌進展[18]。LINC01006作為miR-2682-5p的ceRNA增強HOXB8活性，從而促進胰腺癌的進展[18]。在本研究中，通過基因數據庫預測LINC01006在前列腺癌中的靶作用點，發現miR-34a-5p作為LINC01006海綿化作用對象，抑制前列腺癌的發生和發展，這與既往研究報道的miR-34a-5p阻止細胞遷移和侵襲結論相符[19]。

進一步研究發現，LINC01006在前列腺癌術后病理組織中呈高表達，表達水平與前列腺癌患者的年齡和腫瘤大小無關，與前列腺癌患者的術前PSA值、病理Gleason 評分和病灶轉移情況有關。其表達水平與預后相關，呈現表達越高預后越差，可作為預后評判的分子標志物。

綜上所述，LINC01006在前列腺癌細胞中表達上調，通過調控miR-34a-5p表達，抑制前列腺癌的惡性程度進度，降低復發及轉移率，從而為前列腺癌的早期診斷、治療及預后評估提供理論依據。