甲烷發酵與堿液對堿溶酸析法提取泥炭黃腐酸光譜學變化特征的影響

王震平，路亞楠，鄧雅卉，馬力通，2

(1.內蒙古科技大學 化學與化工學院，內蒙古 包頭 014010；2.生物煤化工綜合利用內蒙古自治區工程研究中心，內蒙古 包頭 014010)

我國泥炭資源極其豐富，但其空間分布不均衡[1]。目前我國泥炭主要作為一種能源礦產，簡單處理后供給園藝、肥料等領域[2]。諶佳偉等[3]研究發現，在微生物作用下，神農架大九湖泥炭濕地持續產出甲烷，CH4的年總排放量達5.57 g/m2，日平均排放速率10.96 nmol/(m2·s)。郝思雯等[4]研究發現，添加稀土化合物有助于提高微生物的活性，促進甲烷發酵過程，增大甲烷產量。

腐植酸(HA)是一類結構復雜的芳香羧酸化合物[5]。黃腐酸(FA) 是腐植酸中既溶于酸又溶于堿的組分，其分子量較小，溶解度較好，生物活性較高，含氧官能團較多[6]。張遠琴等[7]采用焦磷酸鈉溶液作溶劑，探索了濃度、反應時間和反應溫度對腐植酸提取率的影響，最優工藝條件為：焦磷酸鈉溶液濃度為0.03 mol/L，96 ℃下反應1.6 h，提取率達95.68%。

本文聯合甲烷發酵與提取黃腐酸，探索不同堿液與甲烷發酵對黃腐酸的產率、純度以及結構的影響，嘗試揭示不同來源黃腐酸間的差異，希望進一步了解甲烷發酵與黃腐酸提取的結合機制，使泥炭資源得到充分利用。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

草本泥炭，來自吉林吉祥泥炭有限公司；活性污泥，由包頭南郊的污水處理廠提供；黃腐酸，色譜純；氫氧化鈉、碳酸鈉、NaHCO3、氨水、硫酸、亞硫酸鈉、硫酸亞鐵銨、重鉻酸鉀等均為分析純。

AMPTS Ⅱ自動甲烷潛力測試系統；RX1傅里葉變換紅外光譜儀；CAYR 5000紫外可見近紅外分光光度計；LS55熒光發光光譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 泥炭甲烷發酵 將40 g 100目草本泥炭與3%的氫氧化鈉溶液(固液比為1∶12)混合，70 ℃水浴加熱110 min。調節pH于6.9～7.1范圍內，加入活性污泥，進行厭氧發酵，直至日產氣量降至 0 mL 停止發酵，同時做空白實驗。泥炭發酵后過濾，取發酵殘余物，提取黃腐酸。

1.2.2 黃腐酸的提取 取等量的烘干泥炭發酵殘余物，加入5%的亞硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水浸泡24 h，固液比(g/mL)為1∶4。加入20倍體積蒸餾水，80 ℃加熱攪拌2 h。離心取上清液，采用5% 硫酸溶液調節pH至2～3，再次離心，取上清液，測定黃腐酸含量，計算黃腐酸的產率。

(1)

式中V——提取的黃腐酸溶液總體積，mL；

B——提取的黃腐酸溶液濃度，g/mL；

m——提取黃腐酸所用泥炭的質量，g。

1.3 分析方法

1.3.1 黃腐酸含量測定 移取1.00 mL上清液于100 mL錐形瓶中，依次加入5.00 mL濃度0.4 mol/L重鉻酸鉀、15 mL濃硫酸，置于沸水浴中，加熱氧化30 min，冷卻至室溫后，加入3～5 d鄰菲羅啉指示液，采用硫酸亞鐵銨滴定，溶液由橙色經綠色變為磚紅色[8]，記錄消耗硫酸亞鐵銨體積，同時作空白實驗。

(2)

式中B——黃腐酸含量，g/mL；

0.003——碳的毫克當量，g；

V0——滴定空白時消耗硫酸亞鐵銨的體積，mL；

V1——滴定樣品時消耗硫酸亞鐵銨的體積，mL；

N——硫酸亞鐵銨的摩爾濃度，mol/L；

C——腐植酸含碳比的換算系數(腐植酸為0.58，黃腐酸為0.54)；

V——樣品體積，mL。

1.3.2 紫外可見光譜分析[8]將1 g黃腐酸樣品溶解于100 mL碳酸氫鈉溶液中，用0.1 mol/L的鹽酸或1%的氫氧化鈉調節pH為8.0。使用紫外全波長掃描儀掃描范圍為200～800 nm。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析[9]稱取1 mg烘干的黃腐酸樣品，用傅里葉紅外光譜儀測定紅外光譜。

1.3.4 熒光光譜分析 將1 g黃腐酸樣品溶解于100 mL碳酸氫鈉溶液中，用0.1 mol/L的鹽酸或1%的氫氧化鈉調節pH為8.0。用熒光光譜儀掃描，激發波長為274 nm，狹縫寬度8 nm，掃描速度 1 000 nm/min，掃描范圍275～650 nm。

2 結果與討論

2.1 氫氧化鈉預處理發酵后對甲烷產氣的影響

NaOH預處理對CH4產氣的影響見圖1。

圖1 總產氣量

由圖1可知，添加NaOH后，泥炭生物甲烷化總產氣量明顯提升?？瞻捉M總產氣量為2 349.8 mL。在NaOH添加體系中，堿處理發酵組總產氣量為 2 638.9 mL，增加了12.3%。這是因為一定濃度的Na+能改變細胞膜的通透性[10]，使微生物更易吸收和利用泥炭的營養物質，致產氣量增加。表明泥炭甲烷化前用氫氧化鈉預處理泥炭，有利于泥炭生物甲烷化。

2.2 堿液對堿溶酸析法提取泥炭黃腐酸的純度及產率的影響

氫氧化鈉預處理對微生物甲烷發酵過程及黃腐酸提取的影響見表1。

表1 黃腐酸的產率及濃度

由表1還可知，經堿預處理后，黃腐酸產率明顯下降，由Na2SO3、Na2CO3、NaHCO3和NH3·H2O溶解泥炭得到的黃腐酸產率分別下降了 8.32%，17.2%，5.6%，27.1%。表明用氫氧化鈉預處理泥炭發酵可消耗利用更多的黃腐酸，促進發酵過程。不同堿液對堿溶酸析法提取泥炭的黃腐酸產率有明顯差異，使用亞硫酸鈉獲得的黃腐酸產率最高，黃腐酸產率下降率較低，為提取高產率黃腐酸的最優堿液。

由表1可知，提取所采用的堿液對黃腐酸的濃度有一定程度的影響，采用氨水提取黃腐酸的濃度較高，直接甲烷發酵采用氨水處理的黃腐酸濃度達1.02 g/L；采用碳酸氫鈉獲得的黃腐酸的濃度較低，為0.68 g/L；提取黃腐酸濃度較高的亞硫酸鈉的黃腐酸濃度為0.83 g/L，僅次于氨水提取的，且其價格較為低廉，故為提取黃腐酸的最優堿液。

2.3 堿液對堿溶酸析法提取泥炭黃腐酸的紅外光譜的影響

黃腐酸的紅外光譜見圖2。

圖2 黃腐酸的紅外譜圖

經氫氧化鈉預處理發酵后，在3 700～3 200 cm-1范圍內，3 700～3 610 cm-1空白組高于堿處理發酵組；3 500～3 250 cm-1堿處理發酵組高于空白組，表明堿處理發酵后，黃腐酸的羥基減少而氨基增多。在2 924，1 680，1 560 cm-1附近，堿處理發酵組吸收峰強度高于空白組，表明堿處理發酵后，黃腐酸的亞甲基、羰基、苯環均增多。堿處理泥炭可以促進甲烷發酵過程，致使微生物更活躍，消耗更多的羥基等簡單結構，而苯環等復雜結構無法被消耗。

2.4 堿液對堿溶酸析法提取泥炭黃腐酸的紫外光譜的影響

黃腐酸紫外可見光譜見圖3。

由圖3可知，在210～240 nm出現1～2個吸收峰，不同方法獲得的黃腐酸的紫外譜圖吸收峰在200～800 nm隨波長的增大先增大后逐漸趨于0。黃腐酸在短波位置吸收強且隨著波長的增大而減小，是因為黃腐酸是一種高度不飽和的芳香化合物，使得黃腐酸在紫外區的吸收較強。在280 nm附近出現強吸收且在260～330 nm范圍內會出現吸收平臺，表明黃腐酸具有芳香結構。

圖3 黃腐酸的紫外可見圖譜

E4/E6是研究黃腐酸結構的一個重要指標，E4、E6分別是465，665 nm處的吸光度值，可以反應黃腐酸分子的分子量的大小，與E4/E6的比值呈負相關趨勢，即比值越大分子量越小[14]。見圖4，空白組NH3·H2O得到的黃腐酸E4/E6最大為1.94；用碳酸氫鈉獲得的黃腐酸的E4/E6為1.48，為最小值，用氨水溶解獲得黃腐酸分子量較小，用碳酸氫鈉獲得的分子量較大。

圖4 黃腐酸的E4/E6

經氫氧化鈉預處理發酵后得到的黃腐酸E4/E6明顯增大，氨水獲得的黃腐酸E4/E6比值達3.11，比將泥炭直接甲烷發酵后提取的黃腐酸提高 60.3%，經氫氧化鈉預處理發酵后黃腐酸的分子量均下降，表明氫氧化鈉預處理可以促進甲烷發酵過程，更多的黃腐酸被微生物利用、消耗，生成更多的甲烷，這與記錄的總產氣量結果吻合。

2.5 堿液對堿溶酸析法提取泥炭黃腐酸的熒光光譜的影響

由圖5可知，黃腐酸熒光光譜均在400～450 nm處有吸收峰，栗婷婷等研究表明，在310～550 nm的熒光峰為類富里酸和類腐植酸物質[15]。由于黃腐酸結構復雜，含有多種不飽和基團，使其產生的吸收峰相互交疊，形成見圖5的光譜。

圖5 黃腐酸的熒光光譜

相比黃腐酸標準品的熒光光譜，不同方法的黃腐酸的最大出峰位置均發生藍移，1-Na2SO3、1-Na2CO3、1-NaHCO3和1-NH3·H2O的最大峰位置分別由標準品的432 nm藍移至420，419，415，414 nm 處。表明不同方法獲得的黃腐酸結構不完全相同，分子不飽和基團的種類和數量上有差別。根據Li等[16]研究，有機質中芳構化程度高的稠環等的存在，會導致最大熒光峰發生紅移?？赏茰y發酵過程中黃腐酸部分被微生物消耗利用，芳構化程度降低，最大熒光峰藍移。

3 結論

(1)在NaOH添加體系中堿處理發酵組總產氣量相比于空白組增加了12.3%，由Na2SO3、Na2CO3、NaHCO3和NH3·H2O溶解泥炭得到的黃腐酸產率分別下降了8.32%，17.2%，5.6%，27.1%，表明用氫氧化鈉預處理泥炭發酵可消耗利用更多的黃腐酸，促進發酵過程，生成更多的甲烷。亞硫酸鈉提取黃腐酸產量、濃度均較高，且其價格較為低廉，故為提取黃腐酸的最優堿液。

(2)堿處理發酵后，黃腐酸的羥基減少，氨基、亞甲基、羰基、苯環增多。氨水、亞硫酸鈉溶解獲得黃腐酸有較多的羥基、羰基、苯環，而碳酸鈉溶解得到的黃腐酸各種官能團含量都處于較低水平。

(3)紫外-可見光譜表明，黃腐酸分子芳構化程度較高。從氨水溶解獲得黃腐酸分子量較小，由碳酸氫鈉獲得的黃腐酸分子量較大。經氫氧化鈉預處理發酵后得到的黃腐酸E4/E6明顯增大，經氫氧化鈉預處理發酵后黃腐酸的分子量均下降。

(4)不同方法獲得的黃腐酸結構不完全相同，分子不飽和基團的種類和數量上有差別，發酵過程中黃腐酸部分被微生物消耗利用，芳構化程度降低。