糠醛渣與磺化糠醛渣復合材料固定HRP降解苯酚

畢淑嫻，郝紅英，雷文雅，詹海鵑，劉萬毅

(省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室 化學國家級實驗教學示范中心寧夏大學 化學化工學院，寧夏 銀川 750021)

酚類化合物是工業上常見的有毒有機污染物，含酚廢水在我國水污染控制中被列為重點解決的有害廢水之一，它的大量排放對土壤和水體造成嚴重的污染，嚴重危害動植物和人類的健康[1]。隨著工業的發展，含酚廢水的種類與數量都日益增加，廢水治理也是科學工作者急需解決的環保問題[2-3]。辣根過氧化物酶(HRP)是一種從植物中提取出來的過氧化物酶[4]，在過氧化氫或其他有機過氧化物存在下，可以催化芳香族化合物的氧化，被廣泛應用于有機合成、聚合物合成、含酚類化合物廢水的處理等各個方面[5-6]。所謂固定化酶，是指通過物理或化學方法將酶固定在一定空間范圍內，酶仍能保持其高效的催化性能，并能反復、連續使用的酶[7-9]。與游離酶相比，固定化酶具有保持其高效、專一及溫和的酶催化反應特性，尋找高效恰當的載體材料和有效的固定方法仍是該領域值得研究的大問題。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

糠醛渣，工業級；殼聚糖(CTS)、辣根過氧化物酶均為生化試劑；冰乙酸、戊二醛、4-氨基安替比林、苯酚、30%過氧化氫、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為分析純；純凈水(1.5 L，娃哈哈)。

PSHJ-5酸度計；UV-1800PC紫外分光光度計；KQ-250E超聲波清洗器；BC/BD-111HC冰箱；JD200-4電子分析天平；SHA-C數顯恒溫振蕩器；KA-1.0離心機。

1.2 兩種交聯糠醛渣材料的制備

1.2.1 糠醛渣復合材料制備 稱取1 g糠醛渣(40～60 m)，加入10 mL 3%的殼聚糖溶液，磁力攪拌12 h，靜置。倒去上清液，洗滌至中性，過濾，在 80 ℃ 烘干。輕微研磨，得FR-CTS材料。

1.2.2 磺化糠醛渣復合材料制備

1.2.2.1 糠醛渣的磺化 稱1 g糠醛渣(40～60目)于釜內膽，邊磁力攪拌，邊滴加3 mL濃硫酸，攪拌30 min，靜置48 h。于烘箱內150 ℃下反應 4 h，冷卻至室溫。水洗至中性，過濾，將其在80 ℃烘干。輕微研磨，得磺化糠醛渣材料SFR。

1.2.2.2 SFR-CTS材料制備 稱取1 g磺化糠醛渣，加入10 mL 3%的殼聚糖溶液，磁力攪拌12 h，靜置。倒去上清液，洗滌至中性，過濾，在80 ℃烘干。輕微研磨，得SFR-CTS材料。

1.2.3 交聯糠醛渣材料的制備 稱取FR-CTS材料和SFR-CTS渣材料各1 g，加入20 mL 3%的戊二醛溶液，磁力攪拌8 h，靜置。洗去多余的戊二醛，洗滌3～5次，置烘箱80 ℃烘干，研磨，得到交聯糠醛渣復合材料(FR-CTS-GA)和交聯的磺化糠醛渣復合材料(SFR-CTS-GA)。

1.3 FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA固載酶的制備

1.3.1 0.1 mol/L pH=5.0，6.0，7.0，8.0，9.0磷酸鹽緩沖液配制 分別稱取磷酸氫二鈉17.91 g，磷酸二氫鈉7.801 g，溶解于500 mL去離子水。使用時按比例混合，并調節到相應pH。

1.3.2 1 mg/mL辣根過氧化物酶溶液配制 準確稱取10 mg 辣根過氧化酶，溶解于10 mL pH=7.0磷酸鹽緩沖液中。分裝在數個離心管中，置于冰箱凍存。使用時稀釋到相應比例。

1.3.3 固載酶的制備 分別準確稱取10 mg FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA用pH=7.0磷酸鹽緩沖液定容至10 mL，超聲處理5 min，得到1 mg/mL均一的FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA水溶液。分別加入0.2 mg/mL HRP酶溶液和pH=7.0 的磷酸鹽緩沖液，將各樣品混合均勻后密封，在冰浴條件下置于恒溫振蕩器上固載2 h。

1.4 HRP酶催化降解苯酚

1.4.1 0.8 mol/L苯酚溶液50 mL配制 稱取 3.765 g 苯酚，依次加入12.5 mL 無水乙醇，37.5 mL pH=7.0 磷酸鹽緩沖液，置于棕色試劑瓶冷藏保存。

1.4.2 39.3 mmol/L 4-氨基安替比林50 mL配制 稱取0.399 g 4-氨基安替比林，加入50 mL去離子水，置于棕色試劑瓶中冷藏保存(每隔1周重新配制1次)。

1.4.3 30 mmol/L過氧化氫50 mL配制 取30%(m/m)過氧化氫155 μL，去離子水定容至50 mL，置于棕色試劑瓶中冷藏保存(每隔1周重新配制1次)。

1.4.4 苯酚的催化降解 pH=7.0條件下，加入10 μL 0.08 mol/L苯酚溶液，10 μL 0.1 mo/L過氧化氫，再加入pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液，使得整個反應體系為1 mL，在30 ℃下降解反應12 h，考察苯酚去除率。

2 結果與討論

2.1 載體的表征

2.1.1 FR和SFR-CTS-GA的紅外譜圖 見圖1。

圖1 FR和SFR-CTS-GA的紅外譜圖

2.1.2 糠醛渣和磺化糠醛渣復合材料的光電子能譜 糠醛渣和磺化糠醛渣復合材料的光電子能譜見圖2～圖4。

圖2 糠醛渣的光電子能譜圖

圖3 FR-CTS-GA的光電子能譜

圖4 SFR-CTS-GA的光電子能譜

根據能譜中特征峰掃描譜的峰面積，結合靈敏度因子，可求得糠醛渣、FR-CTS-GA、SFR-CTS-GA表面各組分的原子個數比及質量比，其定量分析結果見表1。

表1 FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA光電子能譜元素分析

由譜圖及光電子能譜元素分析可知，糠醛渣、FR-CTS-GA、SFR-CTS-GA均檢出C、O、N元素，其中O 1s元素含量分別為31.86%，30.53%，29.11%，C 1s 元素含量分別為67.75%，68.32%，66.42%，SFR-CTS-GA檢出S元素，接入了磺酸基，成功磺化。

圖5為FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA表面C 1s的高分辨波譜。

圖5 FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA表面C 1s的高分辨波譜

由圖5可知，C 1s有4個峰：C Ⅳ(281 eV)，脂肪烴碳原子；C Ⅱ(282.3 eV)，與酚類、醇類、醚類相連的碳；C Ⅲ(283.3 eV)，羰基中碳；C Ⅰ(285.8 eV)，碳酸鹽或吸附的CO和CO2中的碳。

2.2 HRP的固載

2.2.1 固載酶的熱穩定性 溫度是酶在使用過程中影響其使用效果的重要因素之一，溫度的變化會影響到酶的結構，進而影響到酶活性。因此需要考察不同溫度下游離酶和固載酶的的酶活力。取游離酶和兩種固載酶樣品各5個，在其余條件不變的前提下，在20～60 ℃的溫度范圍內測定各樣品活性，以相對酶活為縱坐標作圖，結果見圖6。

圖6 溫度對固載及游離酶的影響

由6圖可知，游離酶在40 ℃時酶活性最高， SFR-CTS-GA固載酶和FR-CTS-GA固載酶最高酶活性也在40 ℃。在高溫時，固載酶的熱穩定性較游離酶有了提高，這可能是由于高溫時游離酶的酶構象發生變化，導致活性喪失，而固載酶避免了在熱量傳導過程中造成酶結構變形或損壞。

2.2.2 固載酶的時間穩定性質 取兩種固載酶平行樣品，在0.1 mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液中于 4 ℃ 冷藏避光保存，每隔一段時間取出進行酶活測定，結果見圖7。

圖7 儲存時間對固載的影響

由圖7可知，兩種固載酶的半衰期為10 d，儲存穩定性較好，FR-CTS-GA固載酶的穩定性相對更好，SFR-CTS-GA固載酶保存15 d后，活性僅為原來的33%，而FR-CTS-GA固載酶在相同條件下，活性降為原來39.7%。這可能是由于交聯時戊二醛過量所造成的。兩種載體通過戊二醛進行交聯之后，本應該穩定性更強，但過量的戊二醛會影響HRP空間結構的穩定性，甚至扭曲HRP的特定活性位點，導致酶的構象發生變化，造成酶活性的下降，還會影響到載體表面結構，導致酶不易被固定。

2.2.3 固載酶的動力學參數 固定測定酶活力溶液中的過氧化氫濃度，只改變苯酚的濃度，其他條件均相同。測定不同的苯酚濃度下的體系的吸光度，轉換為酶促反應速率，以苯酚濃度的倒數為橫坐標，測得的反應速率的倒數為縱坐標作圖求得Km值。三種酶樣品的Lineweaver-Burk曲線見圖8。

圖8 游離酶與固載酶的Lineweaver-Burk曲線

由表2可知，游離酶與固載酶的Km值相對大小為FR-CTS-GA固載酶

表2 游離酶與固載酶動力學參數

2.3 HRP酶催化降解苯酚

2.3.1 溫度的影響 pH=7.0條件下，加入10 μL 0.08 mol/L苯酚溶液，10 μL 0.1 mol/L 過氧化氫，再加入pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液，使得整個反應體系為1 mL，分別在20，30，40，50，60 ℃條件下反應12 h，考察苯酚去除率隨溫度的變化趨勢，結果見圖9。

圖9 溫度對固載及游離酶降解苯酚的影響

由圖9可知，40 ℃之前游離酶和固載酶對苯酚的去除率都隨溫度上升而增加，40 ℃之后游離酶的去除率開始迅速下降，這是由于在較高溫度時，游離酶的活性大大降低的緣故；固載酶對苯酚的降解率整體高于相應溫度下游離酶對苯酚的降解率，說明酶固定化后所得的固載酶具有耐高溫性，在溫度較高時，依然可以保持較好的性能。去除率隨溫度的變化趨勢與酶活性隨溫度的變化趨勢一致，說明苯酚去除率的變化主要與酶活性隨溫度變化有關。

2.3.2 pH的影響 固載后的HRP對pH穩定性高，在pH=4～10都有一定催化活性。加入10 μL 0.08 mol/L苯酚溶液，10 μL 0.1 mol/L 過氧化氫，分別加入pH=5～9的緩沖溶液使整個反應體系為1 mL，在30 ℃下降解反應12 h，pH對苯酚去除率的影響見圖10。

圖10 pH對固載及游離酶降解苯酚的影響

由圖10可知，苯酚降解率隨pH增大而增大，在pH=8時達到最大降解率，隨后降解率隨pH增大而減小。而固載酶對苯酚的降解率整體受pH的影響較小，堿性條件下，固載酶對苯酚的降解率高于游離酶對苯酚的降解率。

2.3.3 苯酚濃度的影響 分別加入5，10，15，20，25，30 μL濃度為0.08 moL/L的苯酚溶液，10 μL 0.1 mol/L 過氧化氫，再加入pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液，使得整個反應體系為1 mL，在30 ℃下降解反應12 h，苯酚去除率隨著苯酚初始濃度的變化見圖11。

圖11 濃度對固載及游離酶降解苯酚的影響

由圖11可知，隨著苯酚初始濃度增加，固載酶對苯酚的催化去除逐漸降低?？傮w來看，固載酶比游離酶受苯酚濃度影響較小，SFR-CTS-GA固載酶催化降解苯酚的效率更高。由此可知，固定化酶適宜處理低濃度含酚廢水，對于高濃度含酚廢水，還需進行預處理，使苯酚濃度降低，再進行二級處理，達到排放要求。

3 結論

以糠醛渣和磺化糠醛渣為載體，與殼聚糖組合，形成復合材料，使用戊二醛作為交聯劑，對復合載體材料進行交聯，與適當濃度的HRP酶液混合，冰浴振蕩得到固載酶。固載酶在pH=7，40 ℃時有最高活性，在高溫條件下，固載酶活性高于游離酶，兩種固載酶在使用完第一次后活性就大大降低，而總體來看，SFR-CTS-GA固載酶的重復利用效果更好一些。固載酶在pH=8，40 ℃條件下對苯酚的催化效率最高，固載酶具有更寬的pH適用范圍，堿性條件下，固載酶對苯酚的降解率高于游離酶。在高溫條件下，兩種固載酶對苯酚的催化能力優于游離酶。苯酚起始濃度為1.6 mmol/L，在30 ℃下反應12 h，SFR-CTS-GA固載酶和FR-CTS-GA固載酶對苯酚的去除率可以達到92%，85%。