水中細菌ATP熒光檢測影響因素實驗研究

王秋華，許元龍，王璐璐，張衛風

(華東交通大學 土木建筑學院，江西 南昌 330013)

飲用水輸布過程中，微生物會利用水中營養物質生長繁殖，形成的生物膜會保護致病菌，嚴重威脅飲用水安全[1]。ATP熒光檢測法作為水中細菌含量的主要評價方法[2-6]，具有快速、廉價、操作簡單，且可在低水平下檢測(濃度為1 ng/L的ATP不需濃縮，可直接檢測)的優勢，因而具有廣闊的應用前景[7-9]。Van等采用ATP、AOC等多個指標測定慢沙過濾后成品水的微生物生長潛力，發現ATP與AOC相關性良好[10]。

本文主要研究了發光反應條件、水質條件和試劑存放條件對測試結果的影響，以期可更好地利用ATP發光檢測技術確定飲用水的生物穩定性。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

FeSO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、NaCl、NaAc·3H2O均為分析純；螺旋菌NOX(Spirillumsp.)，購自北納生物微生物菌種保藏中心；ATP可檢測試劑，由BacTiter-GloTMBuffer和BacTiter-GloTMSubstrate的混合液組成；GLOMAXTM20/20檢測試劑，購自 Promega 公司。

GLOMAXTM20/20發光檢測儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 2 000 μg/L碳當量培養液的配制 2 000 μg/L碳當量的培養液配方見表1。按照配方溶解藥品，并定容到1 L。將培養液分裝到200 mL的錐形瓶中，每瓶10 mL，在115 ℃滅菌20 min。

表1 2 000 μg/L碳當量的培養液配方

1.2.2 細菌培養液制備 將NOX菌落接種到 2 000 μg/L 碳當量的培養液中，37 ℃恒溫培養 16 d，低溫4 ℃冷藏保存3個月，作為細菌培養液。

1.2.3 實驗方法 利用GLOMAXTM20/20發光檢測儀測試ATP指標。測試結果有兩種表達方式。其中一種方式是ATP產生的熒光相對發光強度RLU；另一種方式是通過測試已知量的ATP標樣的相對發光強度，將測試樣發光強度轉換成ATP物質的量(nmol/L)。本文采用RLU值表示ATP。

1.2.3.1 常規檢測方法 室溫條件下，按照說明要求將BacTiter-GloTMBuffer和BacTiter-GloTMSubstrate兩種測試試劑混合。取定量配好后的測試試劑，加入樣品混合5 min后的讀數，即是所測相對發光強度(RLU)值。

常規ATP檢測，發光試劑與樣品的發光反應時間需要5 min，才會得到穩定的相對發光強度讀數。讀數并不影響發光反應進行，所以為了盡量縮短ATP測試時間，將試劑與水樣混合后直接采用間隔5 s連續讀數的方式。本實驗采用改進的ATP檢測方法。

1.2.3.2 改進ATP檢測方法 如上配好試劑并加樣后，立即將混合液放入儀器中連續讀數，設置間隔5 s，連續手動讀數模式，記錄數據。

2 結果與討論

2.1 發光反應條件的影響

25 ℃條件下，分別將 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL 原菌液與50 μL檢測試劑在1.5 mL的滅菌離心管中混合，立即放入GLOMAXTM 20/20發光檢測儀進行檢測，得到1.5 μL和2.5 μL原菌液測試發光反應到穩定期的兩條數據記錄曲線(圖1)，和發光反應5 s結果(圖2，第1次讀數結果)與發光最大值(圖3，發光穩定期內，在每組連續6次讀數中，當第一個讀數為最大值時，即將其定為最大值)結果的兩條標準曲線。

圖1 細菌培養液ATP熒光檢測結果

由圖1可知，菌液添加量為1.5 μL樣品的相對發光強度在前3次讀數過程中快速上升至 7 418 RLU，隨后上升速度減緩，并于第8次讀數時開始穩定在8 501 RLU左右。菌液添加量為2.5 μL樣品的相對發光強度在前3次讀數中迅速增至 11 761 RLU，隨后增加趨勢減緩，并于第9次讀數后穩定在 13 482 RLU 附近。雖然菌液量不同，但相對發光強度的變化趨勢與達到穩定的時間均相似，即ATP試劑與樣品的發光反應初期發光強度迅速變大，反應到達一定程度后，發光強度基本保持恒定。

同一次測試的結果得到圖2、圖3兩條菌量與ATP相對發光強度標準曲線。圖2是根據5 s讀數建立的，圖3是根據最大值讀數建立的。結果表明，雖然發光反應初期光強增長劇烈，但對其發光強度與菌量間的相關性影響很小。即使發光反應僅有 5 s 時，其相對發光強度值和細菌量的標準曲線的R2值仍達到0.979 04，5 s讀數能夠在一定程度上表征細菌量，并且使ATP測試時間顯著縮短。圖3是根據最大值建立的細菌量與ATP相對發光強度值的標準曲線，其R2值為0.993 89。通過比較5 s發光值(圖2)和最大發光值(圖3)與細菌ATP的標準曲線，發現最大值標準曲線的擬合度更好，更能準確反應ATP相對發光強度與菌量的關系。

圖2 5 s發光值與接種菌液量擬合結果

圖3 最大發光值與接種菌液量擬合結果

2.2 水質條件的影響

水質三個類型分別是純水(JC)、龍頭水(L)及細菌培養液(J)。對于龍頭水的測試，采用接菌龍頭水(JL)減去接種前龍頭水(L)數據的方法，去掉龍頭水原本所含細菌的量的影響，即為折算接菌龍頭水(JL-L)。每種水質重復實驗3次。對于接菌純水和接菌龍頭水，水樣與其所加細菌培養液的比值為200 μL∶10 μL，ATP檢測試劑與加樣的比值為 50 μL∶50 μL；對于不接菌龍頭水，ATP檢測試劑與加樣的比值為50 μL∶50 μL；對于細菌培養液，ATP檢測試劑與加樣的比值為50 μL∶2.5 μL；每種水樣的檢測設3次重復。這樣的試驗設計，保障了龍頭水、純水及細菌培養液每次檢測樣本的菌量都為 2.5 μL 細菌培養液，其檢測結果對應的是相同的細菌菌量。結果見表2。

表2 水樣ATP熒光檢測活力結果

由表2可知，3次重復測試結果的變化幅度龍頭水為106 RLU，接菌龍頭水為1 568 RLU，接菌純水為963 RLU，細菌培養液為528 RLU，表明所測樣品中細菌活力的穩定性由強到弱依次是龍頭水>細菌培養液>接菌純水>接菌龍頭水。未接菌龍頭水和細菌培養液的測試結果變化幅度相對較小，兩者所含細菌都是經過長期生長穩定后的狀態，細菌的活力基本保持在穩定值范圍內。而接菌龍頭水和接菌純水的變化幅度都較大，說明細菌進入新的生長環境后，其生長活力會發生變化，變化幅度與水質因素有關系。

此外，表2列出了各水樣ATP檢測的平均值，其中接菌龍頭水(JL)為 18 534 RLU，折算接菌龍頭水(JL-L)為 16 524 RLU，接菌純水(JC)為 23 609 RLU 及細菌培養液(J)為13 820 RLU。雖然折算接菌龍頭水、接菌純水及細菌培養液所測樣品中的細菌含量相同，但三種水樣的測試結果卻有明顯差異。接菌龍頭水未減去本身所含細菌量時，其測試值就明顯小于接菌純水的測試值，這證明并不是龍頭水本身所含菌量導致上述明顯差異。并且相比于接菌龍頭水和折算接菌龍頭水，接種純水與細菌培養液間的差異更大?？芍|對ATP檢測結果會有明顯影響，并且純水對其影響的程度要大于龍頭水。分析導致這個現象的原因，應是細菌接種到新環境中，其能量代謝系統受到營養條件變化的影響，從而導致細菌ATP量發生變化。

2.3 試劑存放條件的影響

檢測試劑采用BacTiter-GloTMBuffer和BacTiter-GloTMSubstrate的混合液，室溫下使用?，F配試劑與連續使用試劑(25 ℃，光照2 d)對不同濃度菌液進行ATP熒光檢測，結果見圖4。

圖4 不同試劑存放條件的ATP熒光檢測結果

由圖4可知，在接種1 μL菌液條件下，采用連續使用的檢測試劑所得檢測結果為6 057 RLU，而采用現配試劑的檢測結果為 10 453 RLU，相差 4 396 RLU。隨著接種量的增加，兩種試劑的檢測差值由4 396 RLU增加至13 787 RLU，即連續使用的試劑檢測結果比現配試劑檢測結果低了40%～50%。表明室溫有光條件下，長時存放檢測試劑會顯著降低ATP熒光檢測的發光強度，導致錯誤判斷飲用水中生物量?？紤]到檢測試劑的發光能力在連續使用中會衰變，建議檢測樣本的同時，定時利用標樣建立標準曲線，依據曲線的轉換系數，將每個時段所測的相對發光強度換算為ATP物質的量，以ATP物質的量作為生物量指標。

3 結論

研究了檢測發光時間、水質條件及試劑存放條件對ATP熒光檢測準確性的影響。在25 ℃條件下，采用5 s間隔連續讀數方式，記錄最大值作為測試結果。這種讀數方式既可以節省測試時間，又能夠保證測試準確性。測試時若需要稀釋，稀釋用的溶劑會在一定程度上干擾測試結果。不同水質會導致ATP測試結果的差異，這個發現對于研究水質生物穩定性具有一定意義。鑒于ATP試劑會因存放條件而衰變，在一定時間和溫度條件下，增加對ATP標樣相對發光強度的檢測，將相對發光強度轉化成ATP物質的量，并以此作為生物量的表征指標。