右心衰、結核及腫瘤性患者胸腔積液中性粒細胞內p38蛋白對IFN-γ及TNF-α表達的影響及意義

陳 乾，楊 靜，張建銀，沈 樂，李 萍，耑 冰，董 輝

胸腔積液(PE)是呼吸內科常見病和多發病癥,臨床根據PE的理化指標區分滲出液和漏出液，然后推測PE的病因并給予相應的治療。對于不同病因的PE，其內細胞成分差異很大，而造成這種差異的原因至今不明[1-2]。本研究通過觀察右心衰、結核以及腫瘤性PE內中性粒細胞中p38蛋白對IFN-γ和TNF-α表達的潛在影響，探尋中性粒細胞在不同病因所致PE內分布差異的可能原因。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集2016年1月-2017年12月我院呼吸內科首診、病因明確、單一病因導致的PE住院患者71例為研究對象，其中男性30例，女性41例。采集其外周靜脈血樣5 mL/人，收集血樣內的中性粒細胞。第一時間通過胸腔閉式引流術抽取PE 20 mL，經特定步驟收集中性粒細胞(NEU),根據NEU來源患者的病因不同，將其分為心衰組(HF組)12例，患者平均年齡(62.91±6.20)歲;結核組(TB組)18例，患者平均年齡(40.05±7.33)歲;惡性組(CA組)15例，患者平均年齡(54.07±7.29)歲。收集另外一個TB組患者的NEU，向其中加入p38蛋白抑制劑SB203580孵育2 h(SB203580濃度為10 μmol/L)，該組記為TB+SB203580組,患者15例，平均年齡(42.93±9.07)歲；收集另外一個CA組患者的NEU，向其中加入SB203580孵育2 h(SB203580濃度為10 μmol/L)，記為CA+SB203580組，患者11例，平均年齡(61.27±6.40)歲；同期選擇我院體檢中心健康體檢者20人(對照組)，平均年齡(44.30±11.42)歲。以上患者一經入院，經患者同意，簽署“知情同意書”。本研究的實驗方案、患者“知情同意書”等相關資料在實施之前，上報寧夏回族自治區人民醫院倫理委員會批準后實施。

1.2 納入標準:①年齡>18歲；②能正確表達自己意愿；③慢性肺源性心臟病所致的心衰源性PE的患者；④結核性胸膜炎導致的結核性PE患者；⑤惡性肺部病灶胸膜轉移導致的惡性胸水患者；⑥患者臨床資料齊全，自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.3 排除標準:①復雜病因導致的PE(合并其他重要臟器疾病，如冠心病、結構性心臟病、先天性心臟病、血液系統疾病、風濕免疫系統疾病、肝腎功能不全、各種傳染性疾病導致的PE等)；②合并高血壓、糖尿病、左心功能不全的患者；③存在類肺炎旁胸水的患者；④拒絕簽署知情同意書的患者。

1.4 診斷標準:滲出性PE和漏出性PE診斷標準符合第八版《內科學》胸腔積液一節中的相關實驗室指標。

1.4.1 右心衰所致PE臨床認定 ：①符合漏出液的診斷標準；②患者可明確診斷為慢性肺源性心臟病，本文所指的心衰均系指右心衰；③胸膜活檢排除結核及惡性腫瘤；④普通PE培養結果陰性。

1.4.2 結核性PE臨床認定：①符合滲出液的診斷標準，胸水腺苷脫氨酶>30 U/L；②胸膜病理活檢發現朗漢氏巨細胞；③普通胸水培養結果陰性，結核分枝桿菌培養陰性或陽性。

1.4.3 惡性PE臨床認定：①符合滲出液的診斷標準；②患者胸膜活檢確認為肺部惡性病灶或在胸水中找到惡性細胞；③普通胸水培養結果陰性，結核分枝桿菌培養陰性。

1.5 主要檢測試劑:中性粒細胞分離試劑盒(天津灝洋)，全血及組織稀釋液(天津灝洋)，紅細胞裂解液(天津灝洋)，細胞洗滌液(天津灝洋)、Trizol試劑(南京凱基)，總RNA提取試劑盒(南京凱基)，反轉錄試劑盒(大連寶生物)、全蛋白提取試劑盒(南京凱基)，磷酸化蛋白提取試劑盒(南京凱基)，BCA蛋白定量試劑盒(南京凱基)；兔抗人p38一抗(北京博奧森)，兔抗人IFN-γ一抗(北京博奧森)、兔抗人TNF-α一抗(北京博奧森)、β-actin一抗(北京博奧森)、山羊抗兔二抗(北京博奧森)，p38蛋白抑制劑SB203580(Selleck生物)。

1.6 研究方法

1.6.1 血液樣本NEU提取:取5 mL全血標本，加入組織稀釋液2 mL混勻，加入中性粒細胞分離液，500 g離心25 min，此時離心管從上至下分為四層，棄去第一、第二層細胞，收集第三層和第四層細胞，染色并放入顯微鏡下觀察。隨后加入細胞洗滌液10 mL，混勻后200 g離心30 min，沉淀1次，洗滌后用紅細胞裂解液裂解紅細胞，再經3次洗滌祛除紅細胞及碎片后，吸取沉淀細胞即為所需NEU。

1.6.2 胸水內NEU提取:取10 mLPE，離心棄上清液，全部細胞沉淀，PBS重懸，沖洗兩次，制成單細胞懸液。然后參照1.6.1的步驟提取PE內中性粒細胞。

1.6.3 各組NEU內p38蛋白及p-p38的表達:分別將各組獲取的NEU裂解，提取NEU內全蛋白，BCA蛋白定量，取樣，經上樣(上樣量40 μg)、電泳、轉膜、封閉、滴加兔抗人p38一抗(一抗稀釋度1∶3 000)4 ℃搖晃12 h，PBST轉膜15min，共3次；滴加生物素標記二抗，4 ℃搖晃3 h，PBST洗膜后行ECL發光，膠片曝光，使用凝膠成像系統進行灰度分析，Western-blot法測定各組p38蛋白條帶光密度值及β-actin條帶光密度值，兩者之比作為p38蛋白表達的相對值；使用同樣的方法獲得磷酸化的p38蛋白(p-p38蛋白表示磷酸化的p38蛋白)表達相對值。

1.6.4 各組NEU內IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA表達:分別以各組獲取的NEU為研究對象。裂解NEU，Trizol試劑提取NEU內總RNA，逆轉錄合成cDNA，用特異性擴增IFN-γ的引物(F：5′ -GATGAAACCCTCAGAAGC -3′； R：5′-ATCTCCCAGGCACAGTCA-3′，117 bp)和TNF-α的引物(F：5′-CGAGTGACAAGCCTGTAGCC-3′；R：5-TGAAGAGGACCTGGGAGTAGAT-3′，171 bp)，以β-actin(F：5′-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′；R： 5′-CCTTCACCGTTCCAGTTTT-3′,149 bp)作為內參進行Realtime PCR(PCR擴增參數：預變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 20 s，退火57 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s，40個循環；最后延伸65 ℃ 10 min)，Realtime PCR檢測得到數據，根據2-△△Ct法分析IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA表達水平。

1.6.5 各組NEU內IFN-γ和TNF-α的表達:以各組獲取的NEU為研究對象，使用類似1.6.3中的方法，Western-blot法分別檢測NEU內IFN-γ蛋白、TNF-α蛋白表達的相對值。

2 結果

2.1 患者一般資料:各組平均年齡比較差異有統計學意義(F=18.84，P<0.05)，HF組年齡(62.91±6.20)歲，TB組年齡(40.05±7.33)歲，各組患者一般資料見表1。

表1 各組一般資料比較

2.2 各組NEU內p38蛋白、p-p38蛋白的表達:與對照組相比，其他各組p38蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組相比，其他各組p-p38蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05),其中，HF組p-p38蛋白表達水平高于對照組；組間比較發現，各組p-p38蛋白表達水平差異有統計學意義(P<0.05)，TB組及CA組p-p38蛋白表達水平高于其他各組，而TB+SB203580組、CA+SB203580組p-p38蛋白表達水平分別低于TB組和CA組；結果見表2、圖1(目錄后)。

2.3 各組NEU內IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA、IFN-γ及TNF-α表達:與對照組相比，各組IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA的表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)，HF組IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA的表達水平均高于對照組；組間比較發現，各組IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA的表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)，其中TB組、CA組IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA表達水平高于其他各組；而TB+SB203580組、CA+SB203580組IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA表達水平分別低于對應的TB組、CA組，見表3。

與對照組相比，各組IFN-γ、TNF-α蛋白表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)，HF組IFN-γ、TNF-α表達水平均高于對照組；組間相比發現，各組IFN-γ、TNF-α的表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)，其中TB組、CA組IFN-γ、TNF-α表達水平高于其他各組；TB+SB203580組、CA+SB203580組IFN-γ、TNF-α表達水平分別低于對應的TB組、CA組，見表3與圖2-圖3(目錄后)。

表3 各組INF-γ mRNA、TNF-α mRNA、INF-γ、TNF-α的表達相對值

3 討論

眾所周知，PE的形成原因眾多。其內細胞及蛋白成分極其復雜。目前，對于PE內細胞成分差異的原因缺乏研究[1]。但可以斷言的是PE細胞成分的差異，必定與細胞間極其復雜的信號轉導密切相關，而這也將為判斷PE性質提供了重要的線索信息。

本研究以臨床中常見的右心衰、結核以及惡性PE內NEU為研究對象，觀察了NEU內p38蛋白及p38蛋白抑制劑SB203580對IFN-γ和TNF-α轉錄及蛋白表達的影響。我們發現各組NEU內p38蛋白表達無差異，而p-p38蛋白表達存在差異，這再次印證了我們前期的研究：p38蛋白通過p-p38蛋白參與信號傳遞作用[3]。本研究發現，TB組及CA組p-p38蛋白表達水平高于其他各組，HF組p-p38蛋白表達高于對照組，這提示右心衰、結核及腫瘤性因素均可增加PE中NEU內p38蛋白的磷酸化水平(即p-p38升高)。這種變化趨勢與Tiegang Liu等人[4]的研究一致，Tiegang Liu等人在炭毒素導致大鼠PE的研究中認為炭疽毒素可提高p-p38蛋白的水平。而本研究中，無論哪種因素(右心衰、結核及腫瘤)均可以推高機體炎癥水平，從而誘發PE產生。

本研究發現TB組、CA組NEU內IFN-γ mRNA、IFN-γ的表達水平均升高，HF組IFN-γ mRNA、IFN-γ表達水平高于對照組。提示右心衰、結核以及腫瘤因素均可提高NEU內IFN-γ mRNA及IFN-γ表達水平；該結果與Carolyn R等人[5]的結果類似，中性粒細胞在受到炎癥等因素刺激后，可不依賴白介素12(IL-12)獨立產生IFN-γ，而IL-12誘導產生IFN-γ[6]。國內彭偉等人[7，8]研究結果亦與我們的結果類似，他們發現p-p38蛋白可促進CD4+T細胞(Jurkat細胞)表達IFN-γ。另外，本研究中使用p38蛋白抑制劑SB203580，通過對p-p38蛋白的抑制，可以觀察到TB+ SB203580組、CA+ SB203580組中IFN-γ mRNA相對值、IFN-γ表達相對值明顯減低，這就間接證明了IFN-γ的轉錄和表達與p38蛋白密切相關，但凡可影響到p-p38蛋白的表達量，即可提高IFN-γ的轉錄和表達水平。

本研究發現TB組、CA組TNF-α mRNA、TNF-α表達水平均升高，HF組TNF-α mRNA、TNF-α表達水平亦高于對照組。該結果提示右心衰、結核以及腫瘤因素亦可提高胸水NEU內TNF-α的轉錄及表達水平；類似的，TB+SB203580組、CA+SB203580組TNF-α mRNA、TNF-α表達水平分別低于TB組和CA組，提示TNF-α的轉錄與表達與p38蛋白密切相關。p38蛋白不僅可以調控TNF-α基因翻譯的起始階段，還參與TNF-α mRNA穩定性的維持。而生成的TNF-α還可以通過多途徑激活更多的p-p38蛋白；這也從側面印證了我們的研究中出現的情況：p-p38蛋白升高，TNF-α mRNA及TNF-α表達亦升高的趨勢，抑制p-p38蛋白后，TNF-α mRNA及TNF-α的表達亦降低。Carolyn R等人的[5]研究指出，炎癥刺激后的中性粒細胞，其產生IFN-γ可以不依賴IL-12,但是需要TNF-α及IL-1β的調節。所以文獻[9]報道稱將IFN-γ與TNF-α聯合檢測可提高結核性胸水診斷的靈敏度和特異度，確有其分子生物學基礎。

綜上所述，我們認為右心衰性PE、結核性PE以及惡性PE內NEU中的p-p38升高，將導致IFN-γ和TNF-α在轉錄及蛋白表達的水平升高。p38蛋白抑制劑SB203580可通過抑制p38蛋白的磷酸化而降低結核組及腫瘤組中性粒細胞內IFN-γ和TNF-α在轉錄和蛋白表達的水平，這種機制參與了中性粒細胞在不同病因的PE內的分布差異。而對于IFN-γ和TNF-α的其他來源(比如來源于T細胞的IFN-γ和來源于巨噬細胞的TNF-α)如何影響NEU內IFN-γ和TNF-α表達及調控，目前仍缺乏研究[10-11]，仍有待于進一步深入研究。