阿托伐他汀對白蛋白誘導的HK-2細胞凋亡的影響及機制初探

陳艷霞，黃 翀，秦曉華，房向東，涂衛平

(南昌大學第二附屬醫院腎臟內科，南昌 330006)

慢性腎功能衰竭中腎小管細胞的凋亡不如急性腎功能衰竭中突出。然而，腎小管細胞凋亡是腎臟功能不全的關鍵特征，蛋白尿在慢性腎病的進展中起著關鍵作用。蛋白尿可誘導人腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cells，HK-2)細胞的凋亡。在慢性腎功能衰竭中，很難確定在規定的時間范圍內因凋亡而死亡的HK-2細胞的絕對數量，但HK-2細胞凋亡對腎功能衰竭的促進作用已被廣泛接受[1]。尿液中的白蛋白被認為是危險因素，對于如何緩解蛋白尿引起的腎功能衰竭問題的研究有著重要意義，因為它們可能成為控制慢性腎病新的治療靶點。目前，阿托伐他汀(atorvastatin，ATO)對于白蛋白誘導的HK-2細胞的凋亡影響尚不明確，因此，本研究旨在探討ATO對白蛋白誘導的HK-2細胞凋亡的影響，并對其可能的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

HK-2細胞來自美國ATCC細胞庫；ATO購自美國輝瑞制藥有限公司；RhoA/ROCK信號通路抑制劑(Y27632)購自美國Sigma公司；HK-2細胞培養基DMEM/F12培養基購自美國Hyclone公司；HK-2細胞培養液中的胎牛血清購自美國Gibco公司；流式細胞檢測儀為美國Beck-man公司產品。RhoA、ROCK1及內參(β-actin)引物序列見表1。

表1 RhoA、ROCK1、β-actin引物序列

1.2 實驗細胞培養及分組

體外培養HK-2細胞，將培養到85%～90%的HK-2細胞隨機分為7組：空白對照組(A組)、白蛋白誘導組(B組：5 mg·mL-1白蛋白)、ATO組(C組：10-8mol·L-1ATO)、低濃度ATO+白蛋白誘導組(D組：10-10mol·L-1ATO+5 mg·mL-1白蛋白)、中濃度ATO+白蛋白誘導組(E組：10-9mol·L-1ATO+5 mg·mL-1白蛋白)、高濃度ATO+白蛋白誘導組(F組：10-8mol·L-1ATO+5 mg·mL-1白蛋白)、RhoA/ROCK信號通路阻斷劑組(G組：10 μmol·L-1Y27632+5 mg·mL-1白蛋白)；予以各實驗組細胞干預培養48 h后，流式細胞儀檢測各組HK-2細胞的早期凋亡，采用RT-PCR檢測各組HK-2細胞RhoAmRNA、ROCK1mRNA的表達。實驗重復3次。

1.3 流式細胞儀檢測HK-2細胞早期凋亡率

各實驗組細胞干預48 h后，收集各實驗組的HK-2細胞。PBS洗滌×2次(2000 r·min-1離心5 min)收集(1～5)×105細胞。加入500 μL Binding Buffer進行HK-2細胞的重懸。加入5 μL Annexin V-FITC混勻后再加入5 μL Propidium Iodide，再次混勻。于室溫下，避光反應5～15 min，在1 h內流式細胞儀上檢測HK-2細胞的早期凋亡率。

1.4 RT-PCR檢測各組HK-2細胞中RhoA、ROCK1 mRNA的表達

培養結束后，棄去培養液后分別收集各實驗組的HK-2細胞，用Trizol提取總RNA進行RNA完整性檢測后，用核酸微量蛋白測定儀進行RNA濃度的測定。取總RNA 1.5 μg逆轉錄合成cDNA，取cDNA 2 μL在2×EasyTaq PCR SuperMix的作用下擴增目標基因(以人β-actin為內參照)，總反應體系為50 μL。RhoA及ROCK1的引物序列如上所述。反應條件：94 ℃預變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，共35個循環。產物完成電泳后采用凝膠成像系統成像并使用Quantity One軟件進行數據分析。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 ATO對白蛋白誘導的HK-2細胞早期凋亡的影響

A組與C組HK-2細胞早期凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)；B組HK-2細胞早期凋亡率較其他各實驗組升高明顯，且差異均有統計學意義(均P<0.05)；D、E、F組HK-2細胞早期凋亡率較B組降低，且差異均有統計學意義(均P<0.05)；D、E、F組HK-2細胞早期凋亡率組間比較差異均有統計學意義(均P<0.05)；在D、E、F組中，干預用的ATO的濃度為逐漸升高，HK-2細胞早期凋亡率呈現逐漸下降的趨勢；G組HK-2細胞早期凋亡率與D、E、F組比較差異均有統計學意義(均P<0.05)；見表2，圖1。

表2 各組HK-2細胞早期凋亡率比較

圖1 各組HK-2細胞早期凋亡率情況

2.2 ATO對白蛋白誘導的HK-2細胞中RhoA/ROCK1信號通路的影響

A組與C組RhoAmRNA、ROCK1mRNA的表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；B組與G組RhoAmRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)，而G組ROCK1mRNA的表達較B組明顯減少；D、E、F組HK-2細胞RhoAmRNA、ROCK1 mRNA的表達較B組減少(均P<0.05)；見圖2，表3。

*P<0.05與A組比；**P<0.05。圖2 各組HK-2細胞RhoAmRNA、ROCK1 mRNA的表達情況

表3 各組HK-2細胞RhoAmRNA、ROCK1 mRNA的表達情況

3 討論

慢性腎臟病的進展過程中，除了有腎間質的纖維化，還伴有腎小管的萎縮。而蛋白尿就是引起腎小管萎縮中HK-2細胞凋亡的危險因素。研究表明，過量的白蛋白可以通過Fas信號途徑[2]、線粒體凋亡途徑[3]、內質網應激[4]、蛋白激酶B途徑[5]等引起HK-2細胞的凋亡。

目前，他汀類藥物是抗動脈粥樣硬化治療的基礎藥物，具有廣泛的臨床應用，尤其是心血管疾病方面，并且顯示出高效和良好的安全性。不僅如此，他汀類藥物在腎臟疾病方面，具有一定的臨床作用。BIANCHI等[6]的研究表明，在患有慢性腎臟病、蛋白尿和高膽固醇血癥的患者中，除了使用ACE抑制劑或ARB方案外，還可以使用ATO治療來降低蛋白尿和腎臟疾病的進展速度；FUENTES等[7]研究發現，在腎移植的同種異體移植前使用ATO，可以減少腎臟的急性炎癥負擔，并促進移植后腎功能的恢復。ATO的預給藥可以通過其抗氧化作用保護腎臟免受亞胺培南誘導的腎毒性[8]。另外，ATO可以減輕心肌細胞凋亡[9]、抑制血管緊張素Ⅱ誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡[10]、抑制人類膽管癌細胞的凋亡[11]等。且ATO能改善碘普羅胺誘導的糖尿病大鼠腎損傷，其保護作用的機制可能與抑制HK-2細胞凋亡有關，且這種保護作用呈現劑量的依賴性[12]。ATO在造影劑腎損傷中具有保護作用，通過調控PERK/eIF2α/CHOP通路減輕造影劑誘導的大鼠腎小管上皮細胞凋亡[13]。而本研究結果發現，ATO可以改善白蛋白誘導的HK-2細胞的早期凋亡的發生。

已證實Rho相關螺旋形成蛋白激酶(ROCK-1和ROCK-2)參與平滑肌的收縮和細胞凋亡[14]。同時，Rho/ROCK信號途徑是調控細胞收縮和凋亡的關鍵環節[15]。ATO可通過抑制ROCK信號通路來預防Ang Ⅱ誘導的人動脈內皮細胞的單層破裂，該機制的發現可以部分解釋他汀類藥物對心腦血管疾病(如顱內動脈瘤)的某些有益作用[16]。另有研究[17]表明，大劑量ATO可迅速抑制促動脈粥樣硬化的Rho/ROCK途徑，而與膽固醇降低無關。辛伐他汀可通過下調ROCK的活性抑制小鼠胚胎干細胞的自我更新[18]。以上研究均提示，ATO在體內的作用機制可能與調控Rho/ROCK信號通路有關，本研究結果顯示，D、E、F組HK-2細胞RhoAmRNA、ROCK1 mRNA的表達較B組減少，予以Y27632進行RhoA/ROCK信號通路阻斷后，其HK-2細胞的早期凋亡率明顯下降，提示RhoA/ROCK信號通路參與白蛋白誘導的HK-2細胞早期凋亡的發生。而ATO發揮抑制白蛋白誘導的HK-2細胞早期凋亡作用的機制可能與部分阻斷RhoA/ROCK信號通路有關。

在臨床應用中，ATO的安全性和耐受性至關重要。薈萃研究[19]分析提示現有數據表明，阿托伐他汀在其治療劑量范圍內(10～80 mg·d-1)通常具有良好的耐受性。ATO對腎臟的作用具有劑量依賴性，在慶大霉素誘導的腎損傷模型研究[20]中發現，低劑量的阿托伐他汀對急性腎損傷中的腎小管上皮細胞具有保護作用。本研究進行了ATO在體外培養的HK-2細胞中10-8mol·L-1、10-9mol·L-1、10-10mol·L-13個濃度的探討，進一步研究將繼續對ATO的濃度梯度進行摸索。

本文目前局限在細胞水平的研究，動物水平及人體水平ATO對腎小管上皮細胞凋亡的作用及其可能機制需要進行進一步的實驗探討。本研究提示ATO可抑制白蛋白誘導的HK-2細胞的早期凋亡，其作用機制可能與部分阻斷RhoA/ROCK信號通路有關，為臨床尋找延緩腎臟疾病進展的治療新靶點提供了理論依據。